В.П. Коваленко, І.Ю. Горбатенко. Біотехнологія у тваринництві й генетиці. Київ "Урожай", 1992

ГЕНЕТИЧНА  ІНЖЕНЕРІЯ

Генетична інженерія — це нова галузь молекулярної біоло­гії, яка розробляє метоли передавання генетичного матеріалу від одного живого організму до іншого з метою одержання но­вої генетичної інформації та управління спадковістю. Розвиток генетичної інженерії пов'язаний з досягненнями сучасної гене­тики, мікробіології й біохімії. Початок цієї галузі покладений П. Боргом (1972), який одержав перші гібридні (рекомбіновані) ДНК .

У нас використовують два терміни—генетична інжене­рія й генна інженерія. Слід зазначити, що назву генетична інженерія використовують в більш широкому понятті, тобто во­на включає й генну інженерію. При цьому до генної інженерії не відносять перебудову генома звичайними генетичними мето­дами, тобто мутаціями, рекомбінаціями.

Розглянено основні генноінженерні підходи, що можуть бути використані в тваринництві. Відомо, що генетичний мате­ріал всіх рослин, тварин, мікроорганізмів являє собою моле­кулу ДИК. Всі клітини організму мають ідентичні копії ДНК, але й ДИК диференціюється від організму до організму. Де­які організми представлені однією молекулою ДНК в своїй клітині (бактерії), а інші — більш ніж однією (гриби, рослини й тварини).

Кожна непорушена молекула ДНК називається хромосо­мою. У багатоклітинних організмів одна запліднена яйцеклі­тина дає початок для створення величезної кількості клітин. Отже, І кожна вихідна молекула ДНК новоствореної зиготи е основою для виникнення гігантської кількості нових, але од­нозначних за зашифрованою генетичною інформацією молекул ДНК.

Структуру ДНК встановили у 1953 р. лауреати Нобелів­ської премії Д. Уотсон і Ф. Крік на основі рентгеноструктур-ного аналізу. Відповідно до їх моделі молекула ДНК має по­двійну спіраль, що складається з двох антипаралельних ну-клеотидних ланцюгів з загальною віссю.

Кожна молекула ДНК (хромосома) складається з окремих одиниць — ґенів, які несуть в собі інформацію, записану чо­тирма літерами коду. Цей код може бути зчитаний за допомо­гою клітинного механізму, що транслює так званий меседж (Інструкцію, вказівку) з кожного гена для синтезу одного конкретного протеїну (рис. 11). Протеїни являють собою мо­лекули, необхідні для життя і виконання основних життєвих функцій, таких як ферментний каталіз біохімічних реакцій в клітинах і будівництво та структурний матеріал для клітин.

Основою проведення генноінженерних досліджень є молеку­ла ДНК, що показано на схемах (рис. 12—18). При цьому роботи виконують в певній послідовності: спочатку виділяють гени з окремих клітин або синтезують їх поза організ­мом, потім включають нові гени у вектор, поєднують ДНК гена й вектора І одер­жують рекомбінантну ДНК; далі переносять визначені гени в геном клітини-хазяї-па, проводять копіювання й розмноження виділених або синтезованих генів у складі вектора (клонування генів) І одержують генний продукт шляхом експериментальної експресії чужорідного гена в реципієнтшй клітині.

Відомо два шляхи виділення генів та створення рекомбінантної ДНК. Перший — за допомогою хімічного синтезу (Корана, 1969), а другий, більш поширений, грунтується на використанні особливих фер­ментів (рестриктаз), які мають властивість розпізнавати чужорідну ДНК, що проникла в в організм, і розщеплювати її в відповідних ділянках.

В результаті утворюються фрагменти різ­номанітних розмірів, які різняться між собою за довжиною. Відомо близько 500 ферментів рестриктаз і кожний розщеплює ДНК специ­фічно.  Хоча  багато  з них  за  специфічністю подібні, проте кількість сайтів (ділянок) роз­щеплення  становить близько  120.  Зазначені ферменти   позбавлені   видової  специфічності. Завдяки цьому можна поєднувати в одне ціле фрагменти ДНК будь-якого походження й долати природні видові бар'єри. У по­передньому матеріалі (див. рисунок 16) схематично зображено дію фрагменту на молекулу ДНК, що зумовлює відокремлення від неї частини нуклеотидів.

Частини й розриви ниток ДНК лігизують (склеюють) за допомогою ферменту лігази. Особливістю виділених ділянок нуклеотидів (генів) є так звані липкі кінці, через що їх можна приєднати до ділянок ДНК плазмід (для рослин І бактерій) або фагів (тварини). Таким чином створюється вектор для пе­ренесення виділених генів у клітину-реципієнт.

Відомо інший шлях одержання фрагментів ДНІ< з липкими кінцями. Для цього виділені або штучно синтезовані ділянки ДНК обробляють ендонуклеазою, яка укорочує її з обох боків. Потім за допомогою ферменту полінуклеотидтрансферазн до­будовують до цих кінців ділянки аденінових і тимідинових ну­клеотидів. Одержану молекулу рекомбінантної ДНК викорис­товують для перенесення чужорідного гена в бактеріальну клітину. Така схема була використана для генів інсуліну, інтер­ферону, імуноглобуліну.

Молекули ДНК, які мають власний апарат реплікації і здатні доставляти в клітину потрібні гени й реплікувати їх, були названі векторами. Найбільш поширені вектори — це різ­номанітні плазміди, які часто спостерігаються у бактерій. Вектори для клітин ссавців будуються на основі вірусів, адено- та ретровірусів.

Потрібно враховувати, Ідо наявність І навіть введення гена у хромосому організму-хазяїна ще не дає можливості одержа­ти продукти його синтезу. Для того, щоб ген міг функціонува­ти, він повинен поряд з частиною, де закодована інформація, мати ще регуляторну ділянку. Це так звані промотор та термінатор. З промотора починається зчитування інформації (транскрипція), а в термінаторі закодовано закінчення транс-крипції з даного гена. Нині створено цілий «арсенал» клоно-ваних промоторів, які дають можливість забезпечити прояв­лення генів у різних типах клітин.

Слід враховувати також, що не всі молекули плазмІдної ДНК можуть мати вставки чужої ДНК і відповідно не будуть рекомбінантними. Більшість плазмід відновлює вихідну кільце­ву структуру. Тому перш за все необхідно відібрати бактерії, що містять рекомбінантнІ плазміди.

Для відбору рекомбінантних ДНК найбільш поширеною е система, при якій чужорідну ДНК вбудовують в частину плаз-мідного гена, що кодує стійкість проти певного антибіотика, наприклад, ампіциліну. У випадку вбудовування чужорідної ДНК цей ген перестає нормально функціонувати, що свідчить про наявність рекомбінантної ДНК.

Молекула рекомбінантної плазміди розмножується в кліти­ні. У процесі ділення бактеріальної клітини вони розподіля­ються між дочірніми клітинами і в кожній з них знову віднов­люють свою кількість. У результаті створюються колонії бак­терій, кожна з яких містить багато копій рекомбінантної ДНК. У кожному такому клоні міститься тільки один відрізок ДНК тварини або рослини, який випадково потрапив у вихідну бак­терію.