СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ.

Е.В. Меркулова

Вестник Херсонского национального технического университета 1(19).
Херсон: ХГТУ, 2006, с. 250-255.

Використання культивованих фібробластів усе більш поширюється для застосування у лікуванні ран.Для ефективності цього методу лікування необхідно, щоб фібробласти мали високу проліферативну та метаболічну активність. Для цього необхідно виявити підхід до оцінки функціонального стану фібробластів, який не передбачає уникнення клітинами звичного середовища перебування. Запропоновано монослой фібробластів розглядати як текстуру та вибрано метод обробки зображення текстури, за допомогою логарифмічно-полярнихсигнатур, які інваріантні до будь якого куту повороту та незначного зміну масштабу. Методика розрахунку детально приведена. Експериментально підібрано більш ефективні енергетична сигнатура та класифікатор текстурних ознак, знайдено необхідна кількість домінантних сигнатур у наборі. За результатами проведених досліджень зроблені виводи.

В настоящее время в медицине для стимуляции заживления ран (ожоги, трофические язвы, свищи, парадонтоз и т.д.) широко используются фибробласты (аллофибробласты). Например, в ожоготерапии применяется метод активного хирургического лечения обожженных с использованием культивированных фибробластов. Суть метода заключается в применении для пластического закрытия ожоговых ран искусственно выращенных в лабораторных условиях аллофибробластов - клеток соединительной ткани, определяющих активность процессов регенерации, в том числе эпителизации [1]. Фибробласты могут быть получены из кожи донора, трупного или абортивного материала в ходе плановых операций по прерыванию беременности. Преимуществами этого метода лечения ран являются небольшие сроки культивирования фибробластов, хорошее приживление трансплантатов (в среднем 97%), возможность создания банка аллогенных клеток, относительно небольшая себестоимость. Однако эффективное лечение достигается при использовании качественного материала.

Постановка задачи и анализ существующих методов. Фибробласты культивируются в течение нескольких дней, а иногда и недель, для прохождения определенного количества пассажей, с целью достижения максимальной жизнеспособности и метаболической активности клеток, после чего только могут использоваться или храниться в морозильных камерах. Качество выращиваемого материала зависит от ряда факторов [2]: условий содержания (стерильность, температура, степень освещения), качества питательной среды, числа пройденных пассажей, периодичности и равномерности пассирования, наличия контактного торможения – снижения пролиферативной активности клеток при достижении ими критической плотности и т.д. Для определения качества выращенного материала необходимо оценивать функциональное состояние клеток.

Существующие подходы к оценке жизнеспособности клеток в большинстве своем основываются на цитохимических, биохимических и цитоэнзиматических методах [3]. Эти методы предполагают обработку клеток химическими препаратами для выявления различной степени интенсивности специфической окраски и позволяют оценивать количество и локализацию исследуемых веществ в клетках. К недостаткам этих методов причисляют временные затраты и субъективность получаемых результатов. В последнее время интенсивно развиваются иммунологические методы анализа клеточной деятельности, например, с помощью моноклональных антител. Клетки обрабатывают моноклональными антителами и подсчитывают количество провзаимодействовавших с ними клеток. Однако, теряется информация о локализации – распределению по клетки исследуемых элементов. Рассмотренные методы имеют общий недостаток - они предполагают оказание воздействия на клетки. Клетки, лишенные пребывания получают дополнительную нагрузку, стресс и последствие этого, как правило, отрицательные. Во избежание таких последствий и для сохранения целостности исследуемых клеточных систем, ведется поиск новых методик определения жизнеспособности клеток с использованием компьютерных технологий.

Решение задачи. В работе предложен новый подход определения жизнеспособности фибробластов - монослой аллофибробластов рассматривается как текстура, с характерными признаками и особенностями, что позволит выполнять обработку этой текстуры современными компьютерными средствами. На рис.1 показаны фрагменты текстуры монослоя аллофибробластов пригодные (хорошие) и не пригодные (плохие) для использования в медицинских целях (1а и 1б соответственно).

Количество мертвых клеток (черных точек) на рис. 1б заметно больше, чем на рис. 1а. Это одна из особенностей, отличающих хорошие и плохие культуры. Клетки плохих культур имеют некоторые другие признаки, например, больший размер, вакуоли внутри клеток и т.д. Такие особенности на данном увеличении микроскопа человеческим глазом заметить невозможно. Поэтому целесообразно исследовать текстуры плохих и хороших монослоев фибробластов специальными методами, для их последующей классификации. При этом методы должны быть инварианты к любому углу поворота - фибробласты наращивают монослой под произвольным углом наклона и незначительному изменению масштаба - оператор наводит фокус на каждый монослой с определенной долей погрешности. В качестве таких методов в работе предложено использовать логарифмически-полярные вивлет сигнатуры [4].

	а)	б)

Рис. 1 Фрагменты текстуры монослоев аллофибробластов: а) – пригодная для использования культура, б) – непригодная для использования культура

Исходное изображение монослоя фибробластов конвертируется в лог-полярное изображение для устранения эффектов поворота. Полученное лог-полярное изображение наклон-инвариантное (угол наклона может составлять от 0 до 360) и почти масштаб-инвариантное. Полярная форма p(a,r) данного NxN изображения f(x,y) вычисляется по формуле (1). Затем рассчитывается лог-полярное изображение для заданного NxN изображения (2):

(1)

где а=0,…,S-1; r=0,…,[N/2]-1; S=R=N.

(2)

где i=0,…,S-1; j=0,…,R-1.

Лог-полярное изображение получается путем сдвига по ряду исходного, при этом яркостные значения исходных пикселей остаются прежними, а меняются координаты их расположения. Лог-полярные изображения текстур с разными углами поворота и масштабом кажутся имеющими только сдвиг по рядам, когда сравниваются с исходной, не повернутой лог-полярной текстурой [4].

Далее полученное лог-полярное изображение подвергается вивлет преобразованию, с использованием пары квадратурных зеркальных фильтров (высокочастотных и низкочастотных). Это вивлет преобразование отличается от стандартного двумерного вивлет пакетного преобразования тем, что является адаптивным и инвариантным к сдвигу ряда (полученном при создании лог-полярного изображения). В [5] показано, что главным недостатком 2-мерного дискретного вивлет пакетного является зависимость от сдвига входного сигнала благодаря двунаправленной структуре вивлет разложения, а также чувствительность к повороту, т.е. одно и то же изображение в разных наклонах и незначительном изменении масштаба будет иметь разные вивлет коэффициенты. Особенность используемого в работе вивлет разложения заключается в расчете избыточного количества наборов коэффициентов для получения инвариантности к вращению и масштабу. Вначале необходимо вычислить максимально возможное количество уровней разложения, для изображения NxN (3):

(3)

Для каждого уровня, рассчитывается 4 периодических изображений без сдвига, по формулам для вычисления стандартного 2-мерного дискретного вивлет пакетного преобразования , , , . Для получения инвариантности ряда к сдвигу рассчитываются еще 4 периодических изображений (4), (5), (6), (7), каждое со сдвигом на один ряд:

		(4)
		(5)
		(6)
		(7)

где i=0,..,N/2p+1-1; j=0,..,M/2p+1-1;

g(m) и h(n)- пара квадратурных зеркальных фильтров высокочастотного и низкочастотного соответственно;

- задается серыми уровнями изображения, полученного лог-полярным преобразованием.

Для повышения эффективности вивлет преобразования выбираются определенные диапазоны разложенного изображения для декомпозиции в дальнейшем, вместо декомпозиции каждого изображения. Лучший базис представления получается эффективным рекурсивным процессом отбора, который определяет лучшую декомпозицию изображения, основываясь на локальной минимизации функции цены информации. Лучший базис для изображения вычисляется по формуле (8):

(8)

Функцией цены информации, в данной работе, выбрана энтропия Шеннона (9):

(9)

Генерируемые вивлет коэффициенты являются инвариантны к повороту и почти инвариантны к масштабу. Однако, большое число вивлет коэффициентов непригодно для устойчивой текстурной классификации. Уменьшение коэффициентов производится расчетом величины энергии сигнатуры для каждой субзоны. Таким образом, число энергетических сигнатур равно числу субзон, генерируемых адаптивным преобразованием вивлет пакетного сдвига ряда. Число сигнатур может варьироваться, в зависимости от массы полезной информации, заложенной в них.

Таким образом, в результате лог-полярного и вивлет пакетного преобразования, инвариантного к повороту и масштабу, получается заданное заранее количество энергетических сигнатур, характеризующих изображение. В работе рассчитаны 2 энергии сигнатуры – величины среднего значения (10) и стандартного отклонения (11).

		(10)
		(11)

Для решения задачи текстурной классификации изображений монослоя фибробластов выбраны классификатор Махаланобиса (12) и метод сравнения Евклидовых расстояний (13) [6].

		(12)
		(13)

где x– классифицируемый вектор,

v_i – вектор средних для эталонного класса.

Эффективность предложенных лог-полярных вивлет сигнатур для классификации текстур монослоя клеток, а также методов классификации проверена путем проведения серии экспериментов с использованием изображений 10 культур фибробластов, из которых 3 относятся к пригодным для лечения. Эксперименты проведены с целями:

1. Исследовать эффективность текстурной классификации лог-полярного вивлет преобразования, составленного из разных энергетических сигнатур  и разного количества сигнатур доминантной энергии в наборах, характеризующих текстуру, а также исследовать эффективность используемых классификаторов.

2. Исследовать эффективность предложенного метода текстурной классификации на текстурных изображениях только с ротацией или изменениями масштаба.

В табл. 1 приведены результаты исследований эффективности текстурной классификации лог-полярного вивлет преобразования, с различными вариантами использования классификаторов.

Табл.1. Зависимость точности классификации отэнергетической сигнатуры (e₁ - средняя энергия, e₂ - стандартное отклонение) и классификаторов текстур (М - Махаланобиса, Е - метода сравнения Евклидовых расстояний, М+Е – использование одновременно 2-х классификаторов).

Как видно из табл.1 наиболее эффективным является применение энергетической сигнатуры среднего значения e₁. Для классификации текстур изображений фибробластов определено правило принятия решения с одновременным использованием классификаторов Махаланобиса и метода сравнения Евклидовых расстояний. В табл. 1 показано, что, более высокий процент достоверной классификации получается при использовании этого правила.

В проведенных экспериментах количество доминантных сигнатур в наборах было постоянным и равным 96. Данная методика позволяет получать различное количество доминантных сигнатур – до 160. Далее были исследованы результаты классификации текстур на наборах с различным количеством доминантных сигнатур и мерой e₁ (табл. 2)

Число доминантных сигнатур	Критерии классификации и % правильно классифицированных изображений
	M,%	E,%	M+E,%
32	58	60	71
64	67	65	75
96	84	79	98
128	80	73	94

Табл.2. Зависимость точности классификации от количества доминантных сигнатур в наборах.

Как видно из табл.2, наиболее точно классифицируются текстуры, характеризующиеся 96 доминантными сигнатурами.

На рис.1 представлены зависимости точности классификации от различного количества доминантных сигнатур в наборе и измерений энергии: средняя энергия сигнатуры и стандартное отклонение энергии сигнатуры.

Рис.1 Зависимость точности классификации от количества доминантных сигнатур в наборе, 1 – энергетическая сигнатура e₁ (средняя), 2 – энергетическая сигнатура e ₂ (стандартное отклонение).

Наиболее точная классификация текстурных признаков достигнута при использовании энергетической сигнатуры e₁ – средней энергии и 96 доминантных сигнатур в наборе.

При вращении текстуры на произвольный угол достигнута 100% точность классификации, при незначительном изменении масштаба (1,2 - 0,8) точность классификации составляет 91%.Это свидетельствует о том, что инвариантность к ротации в предложенном методе более надежна, чем к изменению масштаба. Изображения равных размеров с измененным масштабом отличается содержанием от изображения с ротацией, т.к. повернутое на любой угол изображение имеет такое же наполнение.

В результате проведенных экспериментов исследована эффективность текстурной классификации лог-полярного вивлет преобразования, составленного из разных энергетических сигнатур и разного количества сигнатур доминантной энергии в наборах, характеризующих текстуру. Показана целесообразность использования экспертной системы, построенной на основе классификаторов Махаланобиса и метода сравнения Евклидовых расстояний. Выбрана энергетическая сигнатура для расчета вивлет коэффициентов – средняя энергия и количество доминантных сигнатур в наборе, равное 96. Исследована эффективность предложенного метода текстурной классификации на изображениях только с ротацией или изменениями масштаба и рассчитана точность классификации: при ротации на произвольный угол – 100%, при изменении масштаба – 91%. Проведенные исследования показали возможность использования в качестве модели процесса определения жизнеспособности клеток автоматизированной системой лог-полярные вивлет сигнатуры с последующей классификацией на основе одновременного использования критериев Махаланобиса и Евклидовых расстояний

ЛИТЕРАТУРА:

1. Алексеев А.А., Саркисов Д.С., Яшин А.Ю., Кашин Ю.Д., Крутиков М.Г. Восстановление кожных покровов на основе применения культвированных аллофибробластов // Материалы городской научно-практической конференции "Новые медицинские технологии в лечении тяжелообожженных, М. - 1997 - с. 52

2. Попандопуло А.Г., Игнатов Д.Ю., Слипченко И.О., Васильев Р.Г., Меркулова Е.В., Герасимов И.Г. Влияние факторов культивирования на жизнеспособность феталъных фибробластов человека. Вестник неотложной и восстановительной медицины, Т.4, №2, 2003, с.323-325.

3. Джеральд М., Фаллер К., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. – М.: Изд. Бином, 2003. – 268 с.

4.Chi-Man Pun, Moon-Chuen Lee. Log-polar wavelet energy signature for rotation and scale invariant texture classification // IEEE Trans. on pattern analysis and machine intelligence, vol.25, no. 5, 2003, p.590-602.

5. Дремин И.М., Иванов О.В., Нечитайло В.А. Вейвлеты и их использование // Успехи физических наук, Т.171, №5, с.465 – 501.

6. Manian V., Castro M., Vasquez R. Texture-based algorithm for color image classification // Proc. SPIE Vol. 4041, 2000, p. 25-33.

К.В. Меркулова

СТВОРЕННЯ МОДЕЛІ ПРОЦЕСУ ВИЗНАЧЕННЯ ЖИТТЕДІЯЛЬНОСТІ КЛІТИН (НА ПРИКЛАДІ КУЛЬТИВОВАНИХ ФІБРОБЛАСТІВ)

Використання культивованих фібробластів усе більш поширюється для застосування у лікуванні ран.Для ефективності цього методу лікування необхідно, щоб фібробласти мали високу проліферативну та метаболічну активність. Для цього необхідно виявити підхід до оцінки функціонального стану фібробластів, який не передбачає уникнення клітинами звичного середовища перебування. Запропоновано монослой фібробластів розглядати як текстуру та вибрано метод обробки зображення текстури, за допомогою логарифмічно-полярних вівлет сигнатур, які інваріантні до будь якого куту повороту та незначного зміну масштабу. Методика розрахунку детально приведена. Експериментально підібрано більш ефективні енергетична сигнатура та класифікатор текстурних ознак, знайдено необхідна кількість домінантних сигнатур у наборі. За результатами проведених досліджень зроблені виводи.

Е.В. Меркулова

СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК       (НА ПРИМЕРЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФИБРОБЛАСТОВ)

Культивированные фибробласты все более широко применяются для лечения ран. Для эффективности этого метода лечения необходимо, чтобы используемые фибробласты обладали высокой пролиферативной и метаболической активностью. Предложенный подход оценки функционального состояния клеток не требует лишать клетки привычной среды обитания. Монослой фибробластов рассматривается как текстура, выбран и описан метод обработки текстур - с помощью логарифмично-полярных вивлет сигнатур, инвариантных к ротации и незначительному изменению масштаба. Экспериментально подобраны энергетическая сигнатура и классификаторы текстур, найдено необходимое количество доминантных сигнатур в наборе. По результатам исследований сделаны выводы.

K Merkulova

CREATION OF MODEL CELLS VIABILITY DEFINITION PROCESS (BY THE EXAMPLE OF CULTIVATED FIBROBLASTS)

Cultured fibroblasts is used to the wounds treatment. Allofibroblasts stimulate wound healing by expression growth factors and components of an extracellular matrix. For efficiency of this method of wounds treatment it is necessary, that the used fibroblasts had high proliferative and metabolic activity. The offered approach of an estimation of a functional cells condition not demand to deprive with a cell of a habitual inhabitancy. Fibroblasts monolayer is considered as a texture, the method of processing of texture - with the help log-polar wavelet signatures, invariant to rotation and minor alteration of scale is chosen and described. The power signature and qualifiers of structures are picked experimentally up, the necessary quantity of signatures in a set is found. By results of researches conclusions are made.

Вверх