Il s'agit de coupler (conjuguer)
l'anticorps, la lectine ou la sonde avec :
soit des billes
d'or colloïdal repérables ensuite en ME ;
l'utilisation de billes de diamètres différents permet des
marquages multiples.
En associant différentes
techniques d'immunohistochimie et/ou d'HIS, utilisant des moyens de marquage et
de révélation différents, des signaux multiples peuvent
être localisés simultanément dans la même cellule.
Ces marquages multiples sont possibles en MO et/ou en ME. Ils
bénéficient grandement de la microscopie confocale.
Il faut produire une image de la
préparation devenue observable, afin de pouvoir la regarder. La
production des images est liée à la mise en oeuvre de moyens
optiques (loupes, microscopes) qui augmentent le pouvoir séparateur de
l'oeil humain (0,2 mm environ) et permettent d'analyser des structures
très petites.
Le microscope optique (ou
photonique), le plus courant, utilise la lumière visible.
La lumière peut être
remplacée par une autre source lumineuse : rayons ultraviolets
(microscope à fluorescence), faisceau d'électrons (microscope
électronique à transmission ou à balayage) ou source laser
(microscope confocal à balayage laser).
Le pouvoir séparateur du
microscope va de 0,2 µm pour le MO à 0,2 nm pour le ME. L'observation
microscopique requiert une bonne connaissance de l'échelle des
grandeurs : le diamètre d'un globule rouge (environ 7,5 µm) et l'épaisseur
d'une membrane plasmique (environ 7 nm) sont des références
courantes.
Associée à
l'observation au microscope, la photographie et le cinéma permettent de
conserver les images. La vidéo permet actuellement d'exploiter au mieux
l'information visuelle : l'image peut ainsi être observée,
communiquée, mesurée, archivée, éditée. Les
signaux, captés par un détecteur, peuvent être transmis
à un système informatique pour être analysés,
amplifiés et/ou numérisés. La numérisation des
images permet leur stockage, leur archivage et leur transmission à
distance par ordinateur.
1.1.3.2 La cytométrie en
flux permet d'exploiter des images sans les regarder
Elle s'applique à
l'analyse de cellules en suspension (naturellement, comme les cellules
sanguines ou dissociées à partir de tissus). Les cellules mises
en suspension dans un flux liquidien passent rapidement une à une devant
un faisceau laser. Le cytomètre en flux permet de mesurer la taille des
cellules, leur granularité ou l'intensité d'un marquage
cellulaire par un fluorochrome. Cette technique est aussi utilisée pour
quantifier l'ADN (par exemple pour l'étude du cycle cellulaire, ou la
détection d'anomalies dans une population de cellules tumorales). Elle
permet également de détecter, de séparer et de collecter
des populations cellulaires spécifiques après marquage.
Il ne suffit pas d'observer les
images produites par les microscopes, encore faut-il les interpréter.
L'interprétation donne une signification aux images observées,
détecte la présence d'une structure, d'une molécule, d'une
fonction chimique et permet de les localiser dans la cellule, le tissu,
l'organe ou l'organisme. L'interprétation est basée sur des
processus de reconnaissance de formes, de contrastes, de couleurs, souvent
combinés de façon peu dissociable dans des processus de
reconnaissance plus globale de « formules », de
« patrons ». Parmi les difficultés d'interprétation,
les plus élémentaires tiennent aux incidences de coupe et aux
artéfacts.
Les images observées sont
situées dans un plan ; elles font partie d'un monde imaginaire
à deux dimensions, à partir duquel il faut restituer le monde
réél à trois dimensions. Dans certains cas, on oriente le
bloc par rapport au plan de coupe, mais le plus souvent les structures sont
coupées selon une incidence due au hasard.
Il faut se méfier des
artéfacts, images artificielles créées par la technique.
Dans une préparation histologique de routine, il peut exister des
artéfacts de prélèvement (pinces, ciseaux, coagulation,
gelures), de fixation (dessèchement, retard de fixation, fixateur trop
ou trop peu concentré), d'inclusion (vides artificiels dus à la
rétraction des cellules ou des tissus), de coupe (stries de rasoir, coupes
trop épaisses ou trop minces), de collage (décollements, plis et
replis de la coupe), de montage (bulles d'air entre la lame et la lamelle), de
coloration (empâtements, dépôts, taches de colorant).
Dues à des imperfections
des moyens optiques d'observation, comme les aberrations de
sphéricité ou les aberrations chromatiques, les
déformations des images peuvent être rapprochées des
artéfacts.
La mauvaise préservation
des tissus est fréquente en histologie humaine, qu'il s'agisse de
prélèvements biopsiques ou per-opératoires (retard de
fixation, tissus situés à proximité de zones
pathologiques) ou surtout de prélèvements post-mortem (autopsies
tardives).