Т.А. Смолягина, О.М. Минаева, Е.Е. Акимова - Биологическая активность бактерий Pseudomonas sp. B-6797 в условиях периодического и непрерывного режимов культивирования

Аннотация

Т.А. Смолягина, О.М. Минаева, Е.Е. Акимова - Биологическая активность бактерий Pseudomonas sp. B-6797 в условиях периодического и непрерывного режимов культивирования В работе установлено, что биологическая активность данного рода бактерий зависит от режима культивирования: непрерывное культивирование повышает биологическую активность штамма продуцента, по сравнению с периодическим. В работе предложено использование данного вида бактерий в качестве биоприпарата

В последнее время в сельском хозяйстве увеличивается применение хи- мических средств защиты растений от вредителей и возбудителей заболева- ний, что приводит к ухудшению экологической обстановки в агрофитоцено- зах. Пестициды оказывают негативное воздействие на различные компонен- ты природных экосистем: уменьшают биологическую продуктивность фито- ценозов, видовое разнообразие животного мира, снижают численность по- лезных насекомых и птиц. Биологический метод рассматривается как альтер- нативный в системе защитных мероприятий и в то же время, в силу своих специфических особенностей, является основой для разработок экологически безопасных, экономичных и долговременных программ борьбы с вредными организмами [1–2].

Бактерии Pseudomonas sp. В-6798, предложенные в качестве агента био- препарата, дают значительный положительный эффект при инокуляции цело- го ряда сельскохозяйственных растений: пшеницы, овса, кукурузы, льна- долгунца, картофеля, огурца. Использование бактериями формальдегида в составе питательных сред в качестве единственного источника энергетиче- ского субстрата, являющегося одновременно ингибитором роста значитель- ного количества других микроорганизмов, позволяет проводить культивиро- вание в режиме незащищенной ферментации, а значит для получения био- массы возможно использовать режим непрерывного культивирования [3–4]. Целью данной работы являлось изучение биологической активности бак- терий Pseudomonas sp. В-6798 в условиях периодического и непрерывного режимов культивирования.

Материалы и методики исследования

Культивирование бактерий проводилось в типовом лабораторном фермен- тере (V = 200 мл) на минеральной среде с формальдегидом (концентрация 2 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Объем посев- ной культуры составлял 10% от рабочего объема биореактора, концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 70–75%.

При непрерывном незащищенном режиме культивирования подача среды осуществлялась включением автономного дозатора по электронному тайме- ру. Одновременно, с помощью перистальтического насоса по установленно- му уровню происходило изъятие излишек культуральной жидкости. В дан- ном режиме были опробованы протоки от 0 до 0,03 ч–1. В установившихся стационарных режимах, определявшихся по отсутствию изменения оптиче- ской плотности культуры, отбиралась проба, в которой учитывались титр продуцента и его биологическая активность. Титр агента и частота культуры определялись фотометрически (спектро- фотометр Apel PD 303, Япония) и методом предельного разведения высева на плотные питательные среды [5]; биологическая активность – по результатам фитосанитарной экспертизы семян (снижение общей пораженности при об- работке и увеличение всхожести и длины проростка) [6]. В качестве контроля использованы семена без бактеризации.

Результаты исследования и обсуждение

В режиме незащищенного периодического культивирования бактерии вы- ращивались до достижения численности 6,8Ч108 клеток/мл. Несмотря на то что маточная культура была однородной и состояла из морфологически идентичных клеток, после периодического культивирования в ферментере без соблюдения правил асептики обнаружены 6 морфологически различных типов колоний, отнесенных нами к различным изолятам, среди которых от- мечено как наличие диссоциантов (численность около 1Ч104 клеток/мл), так и контаминантов (общая численность около 8,5Ч104 клеток/мл). Принадлеж- ность выделенных из культуры изолятов к исходному штамму, контаминан- там или диссоциантам оценивалась по окислению бактериальными клетками формальдегида до муравьиной кислоты в пробирках с формальдегидом и ин- дикатором (бромтимоловым синим) визуально по изменению цвета индика- тора в культурах по сравнению с контрольной пробиркой.

Далее исследуемая бактериальная культура переведена на проточный ре- жим культивирования (D = 0,003 ч–1). По истечении недели культура стаби- лизировалась на протоке с численностью 6,5Ч104 клеток/мл. При посеве на плотную питательную среду наличие диссоциации штамма и посторонней микрофлоры отмечено не было; выросшие колонии морфологически были идентичны колониям исходного штамма. Установлено, что биологическая активность бактерий Pseudomonas sp. В-6798 зависит от режима культивирования: непрерывное культивирование повышает биологическую активность штамма продуцента по сравнению с периодическим. В меньшей степени наблюдается вариация фунгистатиче- ской активности, в большей – ростстимулирующая активность. При бакте- ризации семян культурой, выращенной в периодическом режиме культиви- рования, эффективность подавления семенных инфекций составила 14– 16,5%, а при бактеризации культурой, поддерживаемой в протоке, 24–27%. Бактерии, выращенные в периодическом режиме, способствовали увеличе- нию длины проростков пшеницы в два раза, а бактерии, поддерживаемые на протоке, увеличили длину проростка в шесть раз по сравнению с семенами без бактеризации.

Заключение

Таким образом, переход от периодического режима культивирования к непрерывному, в условиях незащищенной ферментации, способствует под- держанию чистоты бактериального консорциума (на протяжении месяца не- прерывного культивирования не отмечено появления контаминантов в куль- туре) и увеличению биологической активности бактерий.

Литература

1. Боронин А.М., Кочетков В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад // АгроХХI. 2000. № 3. С. 35–41.
2. Соколов М.С., Литвишко Е.В. Биологическая защита растений в США // Защита расте- ний. 1993. № 11. С. 18–20.
3. Минаева О.М., Акимова Е.Е., Семенов С.Ю. Антагонистическое действие на фитопато- генные грибы и стимулирующее влияние на рост и развитие растений формальдегид- утилизирующих бактерий Pseudomonas sp. B-6798 // Вестник Томского государствен- ного университета. Биология. 2008. № 2(3). С. 28–42.
4. Минаева О.М., Акимова Е.Е., Евдокимов Е.В. Кинетические аспекты ингибирования роста фитопатогенных грибов ризосферными микроорганизмами // Прикладная био- химия и микробиология. 2008. Т. 44, № 5. С. 565–570.
5. Практикум по микробиологии : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др. ; под ред. А.И. Нетрусова. М. : Ака- демия, 2005. 608 с.
6. Чулкина В.А. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур Сибири / В.А. Чулкина, Н.М. Коняева, Т.Т. Кузнецова. М. : Россельхозиздат, 1987. 252 с.