Чистяков В. А., Солдатов А., Празднова Е. В. – Возможные механизмы антиоксидантного действия фуллерена С<sub>60</sub>

Авторы: Чистяков В., Солдатов А., Празднова Е. В.
Источник (англ): Chistyakov, Vladimir & Smirnova, Yu & Prazdnova, Evgeniya & Soldatov, Alexander. (2013). Possible Mechanisms of Fullerene C60 Antioxidant Action. BioMed research international. 2013. 821498. 10.1155/2013/821498. URL: https://www.researchgate.net/publication/258503997_Possible_Mechanisms_of_Fullerene_C60_Antioxidant_Action

Аннотация

Был сформулирован новый механизм антиоксидантной активности бакминстерфуллерена C₆₀, основанный на поглощении протонов и слабой разобщенности дыхания и фосфорилирования митохондрий. В настоящем исследовании мы подтверждаем эту гипотезу, используя компьютерное моделирование на основе функциональной теории плотности. Геропротекторная активность фуллерена значительно выше, чем у самых мощных нейтрализаторов активных форм кислорода. В этой работе предлагается, что C₆₀ обладал способностью приобретать положительный заряд, поглощая несколько протонов, и этот комплекс мог проникать в митохондрии. Такой процесс обеспечивает легкое расцепление дыхания и фосфорилирования. Это, в свою очередь, приводит к снижению производства АФК.

Введение

Реактивные виды кислорода (АФК) способны вызывать окислительное повреждение ДНК, липидов и белков и, как известно, являются ключевыми регуляторами клеточной передачи сигналов. Несмотря на критику со стороны ряда исследователей [1], теория свободных радикалов занимает центральное место в современных биологических концепциях старения [2]. Способность замедлять старение характерна для многих антиоксидантов [3 – 5]. Хорошо известная способность свежих овощей, фруктов, красных вин и специй стимулировать продолжительность жизни во многом определяется наличием таких соединений, как депротонированные ксантоны [6], каротиноиды [7], антоцианы и пираноантоцианины [8], а также флавоноиды и терпеноиды [9]. Эти соединения обладают широким спектром оксирадикальной активности гашения, основанной на реакциях одноэлектронного переноса, переноса атома водорода, последовательного переноса электрона через протон, переноса протонной связью электронов, образования радикального аддукта и хелатирования железа [5, 9 – 13].

В недавнем исследовании Баати [14] показали, что пероральное введение суспензии фуллерена С₆₀ в оливковом масле замедляет старение крыс. При этом медиана и максимальная продолжительность жизни увеличиваются примерно вдвое. Кроме того, было показано, что крысы, обработанные фуллереном C₆₀, продемонстрировали высокую устойчивость к тетрахлорметану. Токсичность этого вещества опосредуется генерацией АФК [15]. В соответствии с этим фактом и результатами биохимических испытаний было высказано предположение, что фуллерен C₆₀ обладает высокой антиоксидантной активностью в естественных условиях. Благодаря свободнорадикальной теории старения, высокоактивная антиоксидантная активность может быть основой уникальных антивозрастных (геропротекторных) свойств.

Известно, что фуллерен C₆₀ способен инактивировать гидроксильные радикалы, присоединяясь к двойным связям [16]. Однако этот механизм не может объяснить достаточное (почти в два раза) увеличение продолжительности жизни крыс. Такого рода антиоксидантная активность также связана с природными фенольными антиоксидантами, которые не о бладают высокой активностью замедления старения [17]. Мы предполагаем, что существует дополнительный механизм, участвующий в антивозрастной активности фуллеренов. Дыхательная цепь, расположенная во внутренней митохондриальной мембране, является основным источником супероксидных анионных радикалов, которые приводят к каскаду других токсичных АФК. В связи с этим митохондриально–направленные антиоксиданты, такие как липофильные катионы (ионы Скулачева) с антиоксидантной нагрузкой [18], являются наиболее эффективными противовозрастными средствами (геропротекторами) среди синтетических соединений.

Аккумуляция ионов Скулачева в митохондриях основана на разнице трансмембранного потенциала, возникающей в результате активности цепи переноса электронов. Внешняя сторона внутренней мембраны митохондрий имеет положительный заряд, а внутренняя сторона имеет отрицательный заряд. Таким образом, липофильные катионы концентрируются в митохондриях с помощью сил электрического поля [18]. Липофильные свойства фуллерена С₆₀ хорошо известны [19]. Кроме того, Вонг–Экабут с помощью молекулярно–динамического моделирования [20] показали, что фуллерен C₆₀ способен проникать в мембрану и накапливаться в середине липидного бислоя. Однако при моделировании не учитывается возможное присутствие фуллеренового и/или мембранного заряда. Мы предполагаем, что фуллерен способен поглощать протоны и получать положительный заряд, что позволяет доставлять его в митохондрии. Таким образом, образование супероксидных анион–радикалов снижается за счет легкой разобщенности дыхания и фосфорилирования [21]. В настоящем исследовании мы проводим теоретический анализ способности фуллерена C₆₀ приобретать положительный заряд и поглощать протоны, чтобы доказать, что предложенный механизм действительно может иметь место.

Методы

Все компьютерное моделирование проводилось в рамках теории функционала плотности (density functional theory, DFT) для решения уравнения Шредингера [22], которое ранее использовалось для исследования антиоксидантов [23]. В настоящей работе использовался DFT, реализованный в коде ADF 2012 [24]. Первоначально от одного до семи протонов было размещено вне фуллерена, а затем наиболее вероятная атомная конфигурация была найдена путем минимизации полной энергии системы в процессе оптимизации геометрии, то есть путем нахождения стабильной конфигурации системы, которая соответствует минимум суммарной энергии. Для обменно–корреляционной части молекулярного потенциала использовалось общее градиентное приближение (GGA) в формах GGA–BLYP [25] и GGA–BLYP–D3 [25, 26], но все окончательные результаты были получены с использованием потенциала GGA–BLYP. Основными наборами являются DZ (двойные–ζ) в расчетах, включая молекулы воды вокруг C₆₀ и TZP (тройные–ζ) в расчетах без учета молекул воды вокруг системы C₆₀ плюс–протоны.

Результаты

На первом этапе моделировалось взаимодействие между одиночным протоном и фуллереном. Протон располагался снаружи С₆₀ над одним из пятиугольников на расстоянии около 1 Å от плоскости пятиугольника. В результате протон переходит в фуллерен и, наконец, оказывается внутри фуллерена на расстоянии около 1,1 Å от ближайшего атома углерода (Рис. 1 (а)). Затем в эту систему было добавлено больше протонов; некоторые из них были первоначально размещены над пятиугольниками, но большинство были помещены над шестиугольниками. Первые два протона были расположены на максимально возможном расстоянии друг от друга. Все остальные были равномерно распределены вокруг фуллерена. Во всех случаях протоны были поглощены фуллереном, и так было до тех пор, пока седьмой протон не был добавлен в систему – он оттолкнулся от фуллерена. Таким образом, максимальное количество протонов внутри фуллерена состоит из шести протонов (рис. 1 (б)).

Рисунок 1 – Результаты оптимизации геометрии DFT для одного (а) и шести (б) протонов и фуллерена. Первоначально протоны были размещены вне фуллерена, а затем была найдена конфигурация с минимальным значением полной энергии в результате оптимизации геометрии DFT. В результате все протоны оказались внутри фуллерена. Для моделирования использовался обменно–корреляционный потенциал GGA–BLYP. Атомы углерода показаны серым цветом, а протоны – черным.

Очень важно знать распределение заряда по С₆₀ для каждой конфигурации протонов. На рисунке 2 показано распределение для двух, четырех и шести протонов внутри фуллерена. Видно, что при наличии двух протонов на поверхности фуллерена практически нет заряда. При добавлении четырех–шести протонов поверхность фуллерена приобретает положительный заряд.

Рисунок 2 – Распределение заряда для двух, четырех и шести протонов внутри фуллерена. Заряд фуллерена с двумя протонами внутри равен нулю (красный цвет), в то время как фуллерены с четырьмя или шестью протонами внутри получают положительный заряд (зеленый и синий цвета). Протоны теряют свой положительный заряд, начиная с положительного заряда (синий цвет) до почти нулевого (оранжевый цвет).

В таблице 1 приведена информация об энергиях связи и зарядах VDD [27] для каждого протона, добавленного в систему. Как заряды на протонах, так и относительно большие расстояния C–H позволяют предположить, что протоны взаимодействуют с фуллереном по донорно–акцепторному механизму и не образуют прочных химических связей.

Таблица 1 – Энергии связи и заряды VDD для различных количеств протонов, добавляемых в фуллерен.


Количество протонов	Значения энергии связи, eV	Плотность деформации Вороного (VDD)

1	18.01	0.350

2	22.34	0.345 0.333

3	22.97	0.334 0.314 0.312

4	28.69	0.319 0.308 0.304 0.268

5	28.71	0.281 0.299 0.302 0.278 0.328

Важно знать, повлияет ли присутствие других молекул вблизи фуллерена на способность протонов проникать в фуллерен или нет. Для этого мы провели моделирование с участием молекул воды, которые наиболее распространены в организмах. Хотя известно, что в присутствии как протонов, так и воды появятся ионы гидроксония, молекулы воды могут быть выбраны. В такой среде происходит обмен протонов между ионами гидрония, поэтому в течение небольшого промежутка времени протоны свободны.

Моделирование проводилось для фуллерена с одним протоном, расположенным над пятиугольником, и 47 молекулами воды, случайно распределенными вокруг фуллерена. Было показано, что молекулы растворителя не влияют на способность фуллерена поглощать протон.

Рассуждения

Согласно нашей модели, фуллерен C₆₀, накапливающийся в митохондриях, обеспечивает высокую активность по удалению радикалов в этом субклеточном компартменте, названном Скулачевым самым грязным местом в клетке [28]. Еще один эффективный антиоксидантный механизм основан на мягком разобщении дыхания и фосфорилирования. Дыхательная цепь получает электроны из НАДН и сукцината. Они используются для безвредного четырехэлектронного восстановления кислорода. Но перенос одного или двух электронов может привести к образованию радикалов, опасных для клеток (таких как супероксидные или пероксидные анионы).

Специфика, связанная с генерацией АФК митохондриями, связана с тем, что чем выше мембранный потенциал (чем больше разница в концентрации протонов внутри и снаружи митохондрий), тем выше уровень супероксидного аниона производство. Как было показано [29], существует крутая зависимость митохондриальной генерации супероксид–анион–радикалов от трансмембранного потенциала (Δψ). Даже небольшое (10–15%) снижение Δψ привело к десятикратному снижению скорости производства АФК.

Поэтому так называемые мягкие разобщители окислительного фосфорилирования представляют собой вещества, которые могут перемещать некоторые протоны внутри митохондрий и могут обладать превосходным кислородозащитным эффектом, хотя они не являются антиоксидантами с точки зрения химии [19].

Моделирование DFT позволило нам предложить следующий механизм. Молекулы фуллерена С₆₀ попадают в пространство между внутренней и наружной мембранами митохондрий, где из–за диффузии образуется избыток протонов. В этом отсеке фуллерены загружаются протонами и приобретают положительный заряд, распределенный по их поверхности. Такие заряженные частицы могут переноситься через внутреннюю мембрану митохондрий вследствие разности потенциалов, создаваемых внутренней мембраной, с использованием электрохимического механизма, подробно описанного Скулачевым [18 , 24]. В этом случае трансмембранный потенциал снижается, что, в свою очередь, значительно снижает интенсивность образования супероксидного анион–радикала.

Выводы

Предполагаемая способность фуллеренов С₆₀ приобретать положительный заряд позволяет отнести их к митохондриально–направленным соединениям. Ключевая роль митохондрий в клеточной регуляции делает такие заряженные фуллерены очень интересными на пути разработки новых классов лекарственных препаратов.

Список литературы

1. P. Back, B. P. Braeckman, and F. Matthijssens, ROS in aging Caenorhabditis elegans: damage or signaling? Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2012, Article ID 608478, 14 pages, 2012.

2. A. Bratic andN. G. Larsson, The role ofmitochondria in aging, Journal of Clinical Investigation, vol. 123, no. 3, pp. 951–957, 2013.

3. M. J. Jackson, Strategies for reducing oxidative damage in ageing skeletal muscle, Advanced Drug Delivery Reviews, vol.61, no. 14, pp. 1363–1368, 2009.

4. G. Nguyen and A. Torres, S ystemic antioxidants and skin health, Journal of Drugs in Dermatology, vol. 11, no. 9, pp. e1–e4, 2012.

5. D. M. Small, J. S. Coombes, N. Bennett, D. W. Johnson, and G. C. Gobe, Oxidative stress, anti–oxidant therapies and chronic kidney disease, Nephrology, vol. 17, no. 4, pp. 311–321, 2012.

6. A. Martinez, E. Hernandez–Marin, and A. Galano, Xanthones as antioxidants: a theoretical study on the thermodynamics and kinetics of the single electron transfer mechanism, Food and Function, vol. 3, no. 4, pp. 442–450, 2012.

7. E. Hernandez–Marin and A. Galano A, Martinez, C is carotenoids: colorful molecules and free radical quenchers, Journal of Physical Chemistry B, vol. 117, no. 15, pp. 4050–4061, 2013.

8. S. Alcaro, S. G. C. hiodo, M. Leopoldini, and F. Ortuso, Antioxidant efficiency of oxovitisin, a new class of red wine pyranoanthocyanins, revealed through quantum mechanical investigations, Journal of Chemical Information and Modeling, vol. 53, no. 1, pp. 66–75, 2013.

9. M. Leopoldini,N. Russo, and M. Toscano, Gas and liquid phase acidity of natural antioxidants, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 54, no. 8, pp. 3078–3085, 2006.

10. J. R. Leon–Carmona and A. Galano, Is caffeine a good scavenger of oxygenated free radicals? Journal of Physical Chemistry B, vol. 115, no. 15, pp. 4538–4546, 2011.

11. A. Martinez, A. Galano, and R. Vargas, Free radical scavenger properties of mangostin: thermodynamics and kinetics of HAT and RAF mechanisms, Journal of Physical Chemistry B, vol. 115, no. 43, pp. 12591–12598, 2011.

12. A. Galano and A.Martinez, Capsaicin, a tasty free radical scavenger: mechanism of action and kinetics, Journal of Physical Chemistry B, vol. 116, no. 3, pp. 1200–1208, 2012.

13. M. Leopoldini,N. Russo, S. Chiodo, and M. Toscano, Iron chelation by the powerful antioxidant flavonoid quercetin, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 54, no. 17, pp. 6343–6351, 2006.

14. T. Baati, F. Bourasset, N. Gharbi et al., The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of [60]fullerene, Biomaterials, vol. 33, no. 19, pp. 4936–4946, 2012.

15. M. K. Manibusan, M. Odin, and D. A. Eastmond, Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review, Journal of Environmental Science and Health Part C, vol. 25, no. 3, pp. 185–209, 2007.

16. G. V. Andrievsky, V. I. Bruskov, A. A. Tykhomyrov, and S. V. Gudkov, Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo, Free Radical Biology and Medicine, vol. 47, no. 6, pp. 786–793, 2009.

17. R. Banks, J. R. Speakman, and C. Selman, Vitamin E supplementation and mammalian lifespan, Molecular Nutrition and Food Research, vol. 54, no. 5, pp. 719–725, 2010.

18. M. V. Skulachev, Y. N. Antonenko, V. N. Anisimov et al., Mitochondrial–targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age–related pathologies, Current Drug Targets, vol. 12, no. 6, pp. 800–826, 2011.

19. Y. Xiao and M. R. Wiesner, Characterization of surface hydrophobicity of engineered nanoparticles, Journal of Hazardous Materials, vol. 215–216, pp. 146–151, 2012.

20. J. Wong–Ekkabut, S. Baoukina, W. Triampo, I.–M. Tang, D. P. Tieleman, and L. Monticelli, Computer simulation study of fullerene translocation through lipid membranes, Nature Nanotechnology, vol. 3, no. 6, pp. 363–368, 2008.

21. S. S. Korshunov, V. P. Skulachev, and A. A. Starkov, High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species inmitochondria, FEBS Letters, vol. 416, no. 1, pp. 15–18, 1997.

22. F. M. Bickelhaupt and E. J. Baerends, Kohn–Shamdensity functional theory: predicting and understanding chemistry, Reviews in Computational Chemistry, vol. 15, pp. 1–86, 2000.

23. E. R. Johnson and G. A. Dilabio, Radicals as hydrogen bond donors and acceptors, Interdisciplinary Sciences, Computational Life Sciences, vol. 1, no. 2, pp. 133–140, 2009.

24. G. te Velde, F. M. Bickelhaupt, E. J. Baerends et al., Chemistry with ADF, Journal of Computational Chemistry, vol. 22, no. 9, pp. 931–967, 2001.

25. S. Grimme, J. Antony, S. Ehrlich, and H. Krieg, A consistent and accurate ab initio parametrization of density functional dispersion correction (DFT–D) for the 94 elements H–Pu, Journal of Chemical Physics, vol. 132, no. 15, Article ID 154104, 2010.

26. C. Lee, W. Yang, and R. G. Parr, Development of the Colle–Salvetti correlation–energy formula into a functional of the electron density, Physical Review B, vol. 37, no. 2, pp. 785–789, 1988.

27. C. Fonseca Guerra, J.–W. Handgraaf, E. J. Baerends, and F. M. Bickelhaupt, Voronoi deformation density (VDD) charges: Assessment of the Mulliken, Bader, Hirshfeld, Weinhold, and VDD methods for charge analysis, Journal of Computational Chemistry, vol. 25, no. 2, pp. 189–210, 2004.

28. V. P. Skulachev, How to clean the dirtiest place in the cell: Cationic antioxidants as intramitochondrial ROS scavengers, IUBMB Life, vol. 57, no. 4–5, pp. 305–310, 2005.

29. F. F. Severin, I. I. Severina, Y. N. Antonenko et al., Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria–targeted protonophore, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 107, no. 2, pp. 663–668, 2010.

Возможные механизмы антиоксидантного действия фуллерена С60