Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом. Обычно в эпитоп входит от одной до шести молекул моносахаридов или аминокислот, расположенных на поверхности антигена. Из-за того, что все высокомолекулярные вещества имеют определенную форму в пространстве, именно пространственные взаимоотношения играют главную роль во взаимодействии «антиген-антитело», т.е. антитело должно «подходить» к антигену как ключ к замку. Такой вид эпитопа называют «конформационным». Реже специфичность эпитопа определяется только первичной структурой молекулы, т.е. последовательностью его составляющих, такой эпитоп называют «линейным». Количество возможных мест связывания огромно, каждое такое место уникально, его структура зависит от ковалентных, водородных связей, гидрофильных и гидрофобных взаимодействий внутри молекулы.
Важным этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген-антитело». Выявить антитела, связавшиеся с антигеном, можно используя различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител. Такими метками могут быть:

Данные метки могут быть конъюгированы как с первичными антителами, так и с вторичными. Если метка конъюгирована с первичными антителами (рис.1, А), то такой метод визуализации называется прямым. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одна метка. Чувствительность метода была намного повышена после изобретения непрямого метода: первичные антитела не несли на себе никакой метки, метку несли вторичные антитела (рис.1, Б), для которых первичные антитела являются антигеном. Например, если первичные антитела получены от мышей, то вторичными могут быть кроличьи, специфичные для Fc-фрагмента мышиных иммуноглобулинов. И хотя в реакцию добавляется еще один этап, такой метод имеет некоторые преимущества:

В качестве меток сначала использовали различные флюорохромы. В таблице 1 представлены наиболее часто используемые флюорохромы. Все флюорохромы обладают способностью испускать свет в видимом диапазоне спектра при освещении их светом с определенной длиной волны (табл.1).
Однако, флюоресцентные метки имеют свои недостатки:

Поэтому в дальнейшем были разработаны методы получения стабильных окрасок, чтобы препараты можно было исследовать с помощью обычной световой микроскопии и долго хранить.
Наиболее простой меткой для получения препаратов с длительным сроком хранения являются металлы, например, коллоидное золото. В результате реакции «антиген-антитело» в месте скопления антител в световом микроскопе обнаруживается окрашивание в темный цвет. Долгое время меченные металлами антитела использовались редко из-за низкой чувствительности, однако в 1989 году чувствительность была повышена в 100 раз с помощью метода усиления серебром и микроскопии в поляризованном свете [7]. В редких случаях используются антитела, меченные тяжелыми металлами для последующего электронно-микроскопического исследования препаратов.
Радиоизотопы также используются очень редко из-за высокой опасности облучения персонала. Меченные радиоактивными метками антитела в данный момент используются только для исследований на живых культурах клеток. После обработки культуры ткани антителами с радиоактивными метками по степени излучения можно судить о количестве искомого антигена в тканях.
Наибольшее распространение получили ферментные метки [4]. Одна молекула фермента, конъюгированная с антителом, способна «обработать» большое количество молекул субстрата, образовавшийся нерастворимый краситель накапливается в ткани вокруг фиксированного к антигену антитела.

Таблица 1. Характеристики наиболее часто используемых флюорохромов.


Рис 1. Прямой и непрямой метод визуализации

А – первичное антитело против антигена содержит метку, например, флюорохром. Б – первичное антитело против антигена не имеет метки, после инкубации с первичным антителом добавляют вторичное антитело, которое соединяется с первичным. Метка находится на вторичном антителе.

Рис 2. Конечный комплекс, образующийся при РАР-методе.

Первичное антитело и антитело против пероксидазы в РАР-комплексе должны быть получены от животных одного и того же вида.
Наибольшее распространение в качестве ферментной метки получили пероксидаза хрена, которую впервые применили Накане и Пирс, щелочная фосфатаза и глюкозоксидаза. Для каждого из указанных ферментов существует несколько субстратов, которые под действием фермента образуют нерастворимые красители различного цвета. Возможные сочетания ферментов и субстратов суммированы в таблице 2.
Необходимо помнить, что пероксидаза и щелочная фосфатаза есть и в тканях организма, поэтому иногда можно получить ложноположительные результаты [2,3]. Пероксидаза содержится в большом количестве в нейтрофилах и эозинофилах, поэтому для окраски мазков крови, костного мозга и срезов иммунокомпетентных органов использование этого фермента не рекомендуется. При окраске других тканей небольшая пероксидазная активность блокируется добавлением перекиси водорода перед инкубацией с первичными антителами. Щелочная фосфатаза содержится во многих тканях, поэтому во время инкубации с субстратом в него добавляют левамизол, однако надо помнить, что щелочная фосфатаза кишечника и плаценты не ингибируются левамизолом, поэтому для этих тканей лучше использовать другие ферменты. Глюкозоксидаза может использоваться без ограничений при окраске любых тканей, т.к. в тканях млекопитающих нет такого фермента.
Открытие ферментных меток стало большим шагом вперед при разработке иммуногистохимических технологий, однако все проблемы не были решены. При исследовании антигенов, которые содержатся в небольшом количестве в клетках (например, рецепторов к гормонам на клеточной поверхности, ионных каналов) чувствительность данных систем была явно недостаточной.
Следующим шагом в развитии систем визуализации стали системы с использованием антител против пероксидазы и щелочной фосфатазы (PAP и APAAP-комплексы). Последовательность процедуры следующая. 1 этап: сначала наносятся первичные антитела; 2 этап: наносятся вторичные антитела против первичных (связующее антитело), при этом один из антигенсвязывающих участков вторичных антител связывается с первичным антителом, а второй остается свободным; 3 этап: вносятся антитела против пероксидазы или щелочной фосфатазы, полученные от животного того же вида, от которого получены первичные антитела, антигенсвязывающие участки которого заняты соответствующим ферментом. Эти антитела связываются со вторым антигенсвязывающим участком вторичных (связующих) антител. Таким образом, формируется комплекс, где с одним антигеном оказываются связанными уже 2 молекулы фермента (рис.2), что увеличивает чувствительность метода в 2 раза.
Настоящим прорывом стала разработка в 1979 году метода непрямого иммуноокрашивания с использованием биотин-авидинового комплекса [5,6].

Таблица 2. Ферменты, используемые в иммуногистохимических методиках, и соответствующие им субстраты.


Рис 3. Конечный комплекс при АВС-методе

Комплекс формируется в три этапа. На первом этапе немеченые первичные тела соединяются с антигеном, на втором этапе меченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными, на третьем добавляется комплекс авидин-биотин-фермент, который присоединяется к биотину вторичных антител.
Биотин является витамином H, ниже приведена его химическая формула:

Биотин – соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте. Он является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования). Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. В большом количестве биотин содержится в белках птичьих яиц, где он связан с гликопротеидом авидином, имеющим молекулярную массу 68 кДа. Авидин образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс (КА=1015моль-1). Разрушить такой комплекс можно только при температурной обработке, т.к. авидин разрушается при нагревании. Кроме того, авидин имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки. Таким образом, комплекс биотин-авидин можно использовать как связующий мостик между антителами и ферментами. Для этого готовится комплекс, состоящий из фермента, связанного с биотином, и авидина. В образующемся комплексе три центра связывания авидина связаны через биотин с ферментом или флюорохромом, а четвертый остается свободным (рис.3). После инкубации с вторичными антителами, связанными с биотином, добавляют комплекс авидин-биотин-фермент. Таким образом, с одной молекулой антигена оказываются связанными три молекулы фермента. Данный метод был назван ABC-методом (аббревиатура от английского Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex). К сожалению, и данный метод имеет недостатки, так как авидин соединяется с эндогенным биотином, который в большом количестве содержится в печени и почках, а также он может соединяться с лектинами и заряженными группами в тканях, так как авидин имеет заряд, его изоэлектическая точка лежит в районе pH 10,0.
Дальнейшее развитие получила эта технология после замены авидина на стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii (SaBC-метод). Стрептавидин обладает такими же способностями связывать биотин, как и авидин, то в отличие от него он не имеет заряда в нейтральной среде, не связывается с эндогенным ферментами и намного меньше с эндогенным биотином. Замена авидина на стрептавидин позволила резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода приблизительно в 8 раз.

Таблица 3. Системы визуализации антигенов наиболее известных фирм

Метод	Фирма/система	Примечания
Первично-меченные антитела (ферментами или флюорохромами)	Многие	Количество таких антител велико. Используются редко в иммуногистохимии, но широко в проточной цитометрии.
PAP- и APAAP-метод	DAKO PAP kit DAKO APAAP kit	Метод основан на пероксидазно-антипероксидазном комплексе или фосфатазно-фнтифосфатазном комплексе.
ABC-метод	Novocastra Novostain Super ABC kit VextorLab VectraStain ABC kit	Метод основан на комплексе авидин-биотин-фермент
SaBC-метод	DACO LSAB, LSAB+, LSAB2 Biogenex Super Sentitive Link-Label IHC Detection Systems (Biotin Based) Zymed Histostain-SAP Kit Zymed Histostain-Plus Detection Kit Chemicon IHC Select Detection Kits	Метод основан на комплексе стрептавидин-биотин-фермент
Полимерная технология с первичными антителами	DAKO EPOS	Метод основан на декстрановой молекуле, связывающей до 20 первичных антител и до 100 молекул фермента
Полимерная технология со вторичными антителами	DAKO EnVision, EnVision+ Biogenex Super Sensitive Polymer-HRP IHC Non-Biotin Detection System ImmunoVision PowerVision Zymed SuperPicTure Polymer Detection Kit	Метод основан на декстрановой молекуле, связывающей до 20 первичных антител и до 100 молекул фермента
Метод амплификации с тирамид-биотином	DAKO CSA ImmunoVision ImmunoMax	Метод основан на комплексе стрептавидин-биотин-фермент и усилении комплексом тирамид-биотин
Метод амплификации с тирамид-флюоресцином	DAKO CSA II	Метод основан на комплексе стрептавидин-биотин-фермент и усилении комплексом тирамид-флюоресцеин

Рис 4. Конечный комплекс при методах с применением полимеров

На декстрановой молекуле конъюгированы до 20 вторичных антител и до 100 молекул фермента.
Дальнейшим развитием систем визуализации стала разработка полимерных систем. Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента (рис.4). Таким образом, одна молекула антигена оказывается связанной со 100 молекулами фермента, что обеспечивает крайне высокую чувствительность.
Еще более чувствительными оказываются системы с амплификацией, основанные на тирамиде [1]. Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз (рис.5). С помощью данного метода в тканях можно визуализировать наличие всего одной молекулы антигена. К сожалению, данный метод также подвержен отрицательному влиянию эндогенного биотина.

Рис 5. Конечный комплекс при методах визуализации с амплификацией

Первые три этапа такие же, как и при АВС-методе. Последующие этапы: А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином; Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело»; В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, конъюгированным с тирамидом.
Избавиться от неспецифического окрашивания из-за эндогенного биотина удалось в последнем поколении систем визуализации. В них тирамид связывают не с биотином, а с флюоресцеином, а вместо стрептавидин-пероксидазного комплекса используются антитела против флюоресцеина, меченные пероксидазой хрена. Чувствительность метода при этом не страдает, но отношение «сигнал/шум» оказывается высочайшим.