Киселёв Кирилл Игоревич

Факультет: Компьютерных наук и технологий

Кафедра: Автоматизированные системы управления

Специальность: Компьютерные системы диагностики

Тема выпускной работы:

Создание системы классификации изображений кератиноцитов с целью оценки их жизнеспособности

Научный руководитель: Адамов Владимир Григорьевич

В последние годы большой интерес вызывают исследования, связанные с изучением и применением стволовых клеток в медицине для заместительной клеточной терапии повреждённых тканей. Как указано в многочисленных медицинских источниках [2,4,5], для искусственного формирования полноценной структуры, способной в процессе лечения восстановить все функции кожи, она должна соответствовать определённым требованиям . В последнее время все большее внимание уделяется созданию сложных структур и композиций. Условно клеточные композиции, можно разделить на две группы. Первая — это варианты живого эквивалента кожи, состоящие из коллагенового геля с инокулированными в его состав живыми фибробластами, на по верхности которого культивируются клетки эпидермиса. И вторая — культивируемые заместители кожи, кератиноциты. Кератиноцит — клетка эпителиальной ткани эктодермального происхождения, промежуточные филаменты которой представлены белком кератином. Кератиноциты составляют основную массу эпидермиса кожи млекопитающих. В связи с развитием биотехнологических методов восстановления кожного покрова результаты лечения тяжелообожженных существенно улучшились. В настоящее время применяют, различные модификации метода Грина[5]. Этот метод позволяет в сравнительно короткие сроки выращивать эпителиальные пласты, значительно превосходящие по площади  размеры исходного лоскута кожи. Метод Грина получил заслуженное признание при лечении пострадавших с обширными ожогами, у которых имел место дефицит донорских ресурсов кожи.

Общая схема данного метода  состоит из следующих этапов:  

1) отбор и измельчение биопрепаратов;                          

2) создание питательной среды для кератиноцитов на специальном матрасе;                   

3) формирование пласта в течении нескольких дней;                           

4) оценка текущей готовности;                              

5) отслоение готового пласта от матраса и помещение его на марлю с парафином;    

6)  трансплантация на рану и лечение.

Общая постановка проблемы

Как видно из общей схемы, восстановление кожного покрова пересадкой выращенных  слоёв кератиноцитов является сложной технологией. Одной из причин  неудачных трансплантаций эпителиальных пластов, является недостаточная  готовность пластов к пластике или несвоевременная трансплантация. Оптимальным является пласт, состоящий из 8—12 слоев клеток[2]. При пересадке незрелого пласта, поверхность культурального флакона зарастает клетками неравномерно.

В разных частях пласт имеет неодинаковое количество слоев клеток. Эффективность такой трансплантации невысокая. При трансплантации перезрелого пласта нарушается питание кератиноцитов базального слоя. Также существуют другие факторы влияющие на качество материала при выращивании: нарушение температурного режима, неправильная концентрация диспазы и др. Регулярный контроль жизнеспособности культивируемого пласта, поможет своевременно заметить возможные отклонения и принять решение о сохранении качественного фрагмента пласта или засевании матраса новой культурой. Проблема заключается в том, что несвоевременное освобождение матрасов от заведомо некачественных культур ведёт к потере значительных финансовых средств, а главное времени, которое зачастую является решающим фактором при лечении больных с обширными повреждениями кожного покрова. Материал для пересадки, который нельзя сделать про запас, зачастую необходим в большом количестве и в сжатые сроки.   

Важным этапом для проведения успешной операции, является определение жизнеспособности материала. Существующие подходы к оценке жизнеспособности клеток в большинстве своем предполагают обработку клеток химическими препаратами для выявления различной степени интенсивности специфической окраски и позволяют оценивать количество и локализацию исследуемых веществ в клетках. К недостаткам этих методов причисляют временные затраты и субъективность получаемых результатов. В последнее время интенсивно развиваются иммунологические методы анализа клеточной деятельности. Клетки обрабатывают моноклональными антителами и подсчитывают количество провзаимодействовавших с ними клеток. Однако теряется информация о локализации – распределении по пласту исследуемых элементов. Рассмотренные методы имеют общий недостаток - они предполагают оказание физического воздействия на клетки. Клетки, лишенные среды пребывания получают дополнительную нагрузку, стресс и последствия этого, как правило, отрицательные. Во избежание таких последствий, ведется поиск новых методик определения жизнеспособности клеток с использованием компьютерных технологий, а именно обработка изображений пластов. Сама по себе идея использования снимков не является новой[3], новизна будет заключаться в использовании новых алгоритмов обработки и классификации изображений, а также новых способов принятия решений о сохранении или замене пласта. В  работе  была  поставлена  задача  создания  системы контроля жизнеспособности выращиваемых кератиноцитов, а также прогнозирования  сроков их окончательного созревания, ключевым звеном которой будет классификация изображений, для определения текущей жизнеспособности пласта кератиноцитов. Входными данными для  системы являются  снимки  матрасов  с  клетками, полученные при помощи микроскопа. В качестве результатов программа будет выдавать сведения о жизнеспособности культур: процентное содержание живых клеток на матрасе и предложение о дальнейшем выращивании или засевании новых культур. После получения изображения размером 512х512 пикселей, должны быть получены его характерные признаки, которые будет возможно использовать для классификации. Как указано в работе [1], получить  такой  признак при  помощи  гистограммы яркостей  изображения   либо  стандартных методов оконтуривания невозможно, потому что  яркость клеток  на  изображении  практически равна яркости его фона.  Поэтому  основной  задачей  при  реализации  системы контроля  качества  выращиваемой  культуры  является  выбор математического  аппарата  формирования  признака  принадлежности клеток к живым или мёртвым.

 Изображение слоя кератиноцитов имеет специфическую текстуру.

К тому же при получении изображений присутствует влияние оператора, который может развернуть микроскоп и установить его на разный масштаб. Поэтому классифицирующие признаки должны быть инвариантны к повороту и изменению масштаба. Подобные задачи рассматривались в работе [3], при исследовании фибробластов.  Для решения проблем связанных с поворотом и масштабом, планируется исходное изображение монослоя кератиноцитов конвертировать в лог-полярное изображение для устранения эффектов поворота. Полученное лог-полярное изображение станет наклон-инвариантным и практически масштаб-инвариантным. Полярная форма p(a,r) данного NxN изображения f(x,y) вычисляется по формуле (1). Затем рассчитывается лог-полярное изображение для заданного NxN изображения (2):

(1)

  (2) 

Лог-полярное изображение получается путем сдвига по ряду исходного, при этом яркостные значения исходных пикселей остаются прежними, а меняются координаты их расположения. Лог-полярные изображения текстур с разными углами поворота и масштабом кажутся имеющими только сдвиг по рядам, когда сравниваются с исходной, не повернутой лог-полярной текстурой. Далее полученное лог-полярное изображение подвергается вейвлет преобразованию[6], с использованием пары квадратурных зеркальных фильтров (высокочастотных и низкочастотных). Это вейвлет преобразование отличается от стандартного двумерного вейвлет пакетного преобразования тем, что является адаптивным и инвариантным к сдвигу ряда (полученном при создании лог-полярного изображения). Как сказано в [6], главным недостатком двумерного дискретного вейвлет пакетного преобразования является зависимость от сдвига входного сигнала благодаря его двунаправленной структуре, а также чувствительность к повороту. Особенность используемого вейвлет разложения заключается в расчете избыточного количества наборов коэффициентов для получения инвариантности к вращению и масштабу. Вначале необходимо вычислить максимально возможное количество уровней разложения, для изображения NxN (3):

  (3)

Для каждого уровня, рассчитывается 4 периодических изображения без сдвига, по формулам для вычисления стандартного 2-мерного дискретного вейвлет пакетного преобразования, ,,,. Для получения инвариантности ряда к сдвигу рассчитываются еще 4 периодических изображений (4), (5), (6), (7), каждое со сдвигом на один ряд:

(4)
(5)
(6)
(7)

где i=0,..,N/2p+1-1; j=0,..,M/2p+1-1;
g(m) и h(n)- пара квадратурных зеркальных фильтров высокочастотного и низкочастотного соответственно;
- задается серыми уровнями изображения, полученного лог-полярным преобразованием.
Для повышения эффективности вейвлет преобразования выбираются определенные диапазоны разложенного изображения для декомпозиции в дальнейшем, вместо декомпозиции каждого изображения. Лучший базис представления получается эффективным рекурсивным процессом отбора, который определяет лучшую декомпозицию изображения, основываясь на локальной минимизации функции цены информации. Функцией цены информации, в данной работе, выбрана энтропия Шеннона (8):

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

В результате проведенного анализа  были отобраны предположительные методы оценки жизнеспособности кератиноцитов. Рассмотрены перспективные методы обработки и классификации изображений пластов культуры, которые позволяют оценивать их жизнеспособность без физического воздействия на клетки, а именно лог-полярное и вейвлет пребразования, для создания инвариантности изображения к повороту и масштабу, а также классификатор Махаланобиса и метод сравнения Евклидовых расстояний, для текстурной классификации. В дальнейшем планируется проведение машинных экспериментов с эталонными снимками кератиноцитов, с целью проверки эффективности выбранных методов.

1.   Адамов  В.Г.,  Каира  В.В.  Компьютерная  система  прогнозирования  сроков созревания  кератиноцитов [Текст]/ Адамов  В.Г.,  Каира  //  Моделювання  та  керування  станом  екологоекономічних систем регіону. – Київ: Міжнародний науково-навчальний центр інформаційних  технологій  та  систем НАН України  та МОН України, 3  вип., 2006. - С. 234
2. Смирнов С. В., Киселев И. В., Васильев А. В., Терских В. В. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов. [Текст]/ Смирнов С. В., Киселев И. В., Васильев А. В., Терских В. В. // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова - С. 25
3. Меркулова  Е.В.  Создание  модели  процесса  определения жизнеспособности культивируемых  фибробластов  для  автоматизированной  системы [Текст]/ Меркулова  Е.В. // Вестник Херсонского Государственного  технического  университета. - Херсон: ХГТУ.- 2004 р. -№ 1(19).
4. Лаборатория проблем клеточной пролиферации / [Интернет-ресурс]- Режим доступа: http://idbras.comcor.ru/Celllab/techn.htm
5. Биотехнологические методы моделирования полнослойной структуры кожи / [Интернет-ресурс]- Режим доступа: http://www.rusmedserver.ru/ojogi/72.html
6. Яковлев А. Н. Примеры вейвлет-преобразований.[Текст]/ Яковлев А. Н. // Введение в вейвлет-преобразования - Новосибирск -2003 г