Производство кератиноцитов для непосредственной защиты против бактериальных патогенов кожи

Marissa H. Braff, Mohamed Zaiou, Joshua Fierer, Victor Nizet, and Richard L. Gallo

Перевод с английского.

Источник: Педиатрический факультет,Университет Калифорнии.
http://journal.shouxi.net/qikan/article.php?id=195177

ВВЕДЕНИЕ

    Функции кожи и как барьера и как иммунного органа способного оповещать тело об опасности микробной атаки. Кератиноцит (КЦ), основной тип клеток эпидермиса, традиционно считалось, участие в кожной иммунной защиты двумя способами: путем предоставления физического барьера для вторжения и через высвобождение медиаторов воспаления, которые вербуют фагоцитарные лейкоциты к очагам инфекции (3,65).Тем не менее, все чаще признается, что кератиноциты производят молекулы похожие на антимикробные пептиды (AMPS), используемых нейтрофилов и макрофагов, чтобы убить потенциально патогенных микроорганизмов (8, 14, 16, 18, 43, 49). Эти усилители, как правило, небольшие, катионные, амфипатический молекулы, способы действием разрушать микробные оболочки и модификации клетки-хозяина воспалительных явлений (30, 48).Производство похожих на эпителиальные клетки может предоставлять дополнительный иммунный барьер защиты, но специфической биологической значимости не доказано.

    Несколько семей усилителей были хорошо изучены в кератиноцитах, в том числе и cathelicidins-дефенсинах.С athelicidin (hCAP18/LL-37) и человеческого-дефенсина-2 и -3 (HBD-2 и -3) индуцируются в кератиноциты при воспалении, в то время HBD-1 является конститутивно синтезированные (18, 51). В дополнение к кератиноцитов, cathelicidin является производным от других клеток в коже, в том числе нейтрофилов (57), тучных клеток (15), и экзокринный железы (39). Множество кожных усилителей и сотовых источников способствовало неполное понимание относительного вклада кератиноцитов cathelicidin к кожным обороны барьер.

    Общие воспалительные заболевания кожи, таких как псориаз и атопический дерматит (АД) имеют фенотипы, можно предположить, что различия в AMP производстве могут непосредственно влиять на восприимчивость к инфекции (11, 33, 46). Выражение уровней cathelicidin, HBD-2, и HBD-3 повышается в кератиноцитах псориатических поражений, и вторичной инфекции встречается крайне редко (18, 24, 25, 27, 44). В отличие от больных АД проявляется относительно дефицит cathelicidin и HBD-2 и демонстрируют повышенную восприимчивость к бактериальным и вирусным подкожным суперинфекциям(28, 33, 34, 46). Интересно, что нет явных дефектов нейтрофилов в этих воспалительных заболеваний, предполагая, что выражение пож на эпителиальные клетки могут быть ответственны за наблюдаемые различия в восприимчивости к инфекциям. Двойная функциональность этих усилителей в противомикробное и иммуномодулирующее деятельности подчеркивает важность правильного выражения AMP для оптимальной иммунной защиты кожи.

  Критической функции cathelicidin пож в коже защиту от бактериальной инфекции было показано в cathelicidin-дефицитных мышей (28, 43). Нейтрофилы хранить обильные cathelicidin в его предшественником форме, и их важность для кожный иммунитет также был хорошо документированы. Тем не менее, вклад кератиноциты, которые производят низкой, конститутивной уровней cathelicidin по сравнению с нейтрофилами и upregulate выражение на ранение или бактериальной проблема, пока неясно (16). Это исследование изложенных для оценки антимикробной активности и кожных иммунной обороноспособности кератиноцитов cathelicidin против двух ведущих человеческих патогенов, которые заражают как нормальных, так и с ослабленным кожу, стрептококк группы А и золотистый стафилококк. Представленные здесь результаты показывают, что кератиноцитов синтеза и обработки cathelicidin способствовать врожденный иммунитет кожи, образуя прямой антимикробный барьер обороны, который дополняет циркулирующих иммунных клеток

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и условия культивирования. ГАЗ штамм NZ131, хорошо известных дикого типа (WT) серотипа М49 кожи человека изолировать, которые восприимчивы к cathelicidin пож (43), было распространено в триптического бульоном соевый (БСЭ). Золотистого стафилококка WT штамм SA113 (АТСС 35556) и его изогенных lysophosphatidylglycerol синтазы-дефицитных мутантов ФЗПНМ (47) также распространяются в БСЭ. Бактерии выращивали на логарифмической фазы (оптическую плотность при 600 нм [OD600], 0,9 [108 КОЕ / мл]) и разводят в соответствующую среду для использования в мышь инфекционных проблем или кератиноцитов антимикробных анализов.

    Нейтрофилов истощения. По возрасту и полу соответствием взрослых Cnlp + / + и Cnlp / 129SVJ мышам вводили внутрибрюшинно (ф) дозу (200 мкл) или циклофосфамид (250 мг / кг массы тела) или моноклональных антител RB6-8C5 (450 мкг / мшь ), разрушают циркулирующих нейтрофилов (55, 59). Управление однопометников вводили 200 мкл фосфатно-солевом буфере (PBS), Для оценки длительности нейтропении, периферической крови из-под контроля и нейтрофилов обедненный мышей были собраны в сутки в течение 7 дней с подкожной вены в Microtainer труб с ЭДТА (Becton Dickinson, Франклин озер, NJ). Гематологические анализы были проведены на Core UCSD гематологии фонда с использованием системы Hemavet анализа (CDC технологий).

     Инфекций Подкожный ГАЗ. Мышь инфекции ГАЗ проводились на основе изменений в ранее описанной модели (43). Двадцать четыре часа после нейтрофилов истощения, спины нейтрофилов обедненные и контрольных мышей были бритые и волосы удаляли химической депиляции (Nair). Мыши были заражены подкожно 200 мкл сублетальных доз лог-газовой фазы (1 х 105 до 5 х 105 КОЕ) в комплексе с Cytodex бисером в качестве перевозчика. Цифровые фотографии повреждений кожи были взяты ежедневно, и размер повреждения измерялась с помощью NIH Imager программного обеспечения. Поражения были биопсию на 7 день postinfection для циклофосфамид обработанных мышей и на 3 день postinfection на антитела RB6-8C5-мышей. Изолированные поражения гомогенизировали в PBS использованием PowerGen 125 портативных гомогенизатор (Fisher Scientific, Питтсбург, штат Пенсильвания), для восстановления бактерий. Разведения высевали на кровяной агар и культивировали в течение ночи при 37 ° С для перечисления КОЕ. Чтобы подтвердить, что нейтрофилов населения оставалась подавленной течение инфекции периода, кожные повреждения из-под контроля и нейтрофилов обедненный мышей биопсию ежедневно и фиксировали в формалине для гистологического анализа. Гематоксилин-эозином и (H & E) окрашивание проводилось за счет базового фонда UCSD гистологии. Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX41.

    MIC анализов. Для оценки потенциальной антимикробной активности cathelicidin в клеточной культуральной среде, MIC тесты проводились на основе изменений в ранее описанным методом (39). Короче говоря, золотистого стафилококка и WT ФЗПНМ штаммы выращивали для входа фазы и разводят в БСЭ или антибиотиков EpiLife культуре клеток среды (общим объемом 50 мкл) в присутствии или отсутствии синтетических человека cathelicidin LL-37 пептида в 96-луночного с круглым дном культуры тканей пластин (Corning Inc, Нью-Йорк). LL-37 был использован в концентрации 2 мкМ, 4 мкм, 8 мкМ и 16 мкМ. После инкубации при температуре 37 ° С в течение 4 часов или на ночь, поглощения было читать как OD600 используя спектрофотометр (SpectraMax Plus 384; Molecular Devices, Калифорния) и разведения высевали на агар триптического сои (TSA) и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C. КОЕ были количественно, и процент выживания живых бактерий была рассчитана как (выживаемость клеток после инкубации с пептид) / (выживаемость клеток после инкубации без пептид) х 100.

    Кератиноциты в изоляции и культуры. Человек KC производным от новорожденных крайняя плоть были выращены в бессывороточной EpiLife культуре клеток среды (Каскад биопрепаратов, Portland, OR), содержащий 0,06 мМ Са2 +, 1x EpiLife определенный рост добавка, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина при нормальных тканей условий культивирования. НаСаТ клетки культивировали в среде Дульбекко изменение Орла с 4,5 г / л глюкозы (BioWhittaker; Уолкерсвилл, MD) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина. Чтобы изолировать Cnlp + / + и Cnlp / мышь КЦ, новорожденных мышей 129SVJ были принесены в жертву в течение 4 дней после рождения, до начала роста волос. Кожа была удалена и стерилизуют в Hibiclens антисептическим / антимикробным моющим средством (Zeneca Pharmaceuticals, Уилмингтон, Делавэр). После лечения ночь dispase отделить эпидермиса и дермы, эпидермиса был трипсином в течение 12 мин при 37 ° С до разбивки КЦ. Трипсин нейтрализовали буфер солевой раствор Хэнкса, содержащий 5% Chelex обработанных кальция и подвески KC центрифугировали 10 мин при 1000 мкг для осаждения клеток. Мышь KC ресуспендировали и выросли в бессывороточной 154CF кератиноцитов культуральной среде (Каскад биопрепаратов, Portland, OR), содержащий 0,05 мМ Са2 +, 1x человеческих кератиноцитов дополнения роста, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина.

    Cathelicidin лентивирус производства. Человек лентивирус cathelicidin конструкции были получены, как описано выше для свиней cathelicidin PR-39 (32). Одним словом, человека cathelicidin кДНК (23), соответствующими либо полнометражный hCAP18 предшественника (сигнальный пептид плюс cathelin плюс LL-37), cathelin белка, или зрелая LL-37 пептида усиливался с помощью ПЦР и вставляется в pLenti6/V5 /ТОПО вектор (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) для создания следующих конструкций под контролем промотора цитомегаловируса: pLV/hCAP18, PLV / Cathelin и pLV/LL-37. Вставка и ориентацию генов cathelicidin были подтверждены плазмиды секвенирования. Конструкции были cotransfected смесью упаковки плазмид (pLP1, pLP2 и ПЛП / VSV-G) в человеческих эмбриональных почек 293T клеток. Трансфекции в клетки 293T (1,5 х 106) были проведены в свободной от сыворотки среде с использованием Lipofectamine (Gibco, Карлсбад, Калифорния). Через 12 ч, трансфекции среду заменяли полной среде и клетки были дополнительно выдерживают в течение 72 ч. Вирусный Супернатант собирают и фильтруют (0,45 мкм пор по размерам фильтр). PLV / галлон был использован в качестве положительного контроля. Выражение-галактозидазы забил 5-бром-4-хлор-3-индолил - D-галактопиранозид (X-Gal) окрашивания. Титры были рассчитаны путем подсчета очагов синих клеток на лунку и деления на коэффициент разбавления. В НаСаТ клеток, контроль PLV / LacZ титр примерно 5 х 107 трансдуцирующих ед / мл. pLV/hCAP18, PLV / Cathelin и pLV/LL-37 были также производства переходных трансфекции 293T клеток. Вирусные акции хранились при температуре 80 ° C.

    НаСаТ ячейки трансдукции. Трансдукции НаСаТ клеток с лентивирус акции проводили, как описано ранее (32). Короче говоря, НаСаТ Клетки выращивались в 6-луночных примерно от 30 до 50% слияния.До инфекции, культуральная среда была заменена свободной от сыворотки среде с 8 мкг / мл polybrene. После добавления среды (300 мкл) с 293T клетки, инфицированные hCAP18, cathelin, LL-37, или LacZ, клетки инкубировали при 37 ° С в течение ночи. Двадцать четыре часа спустя, среду заменяли на питательной среде без polybrene. После расширения в культуре в течение 48 до 72 ч, НаСаТ клетки были собраны и проанализированы на cathelicidin выражение путем обратной транскрипции-ПЦР и Вестерн-блоттинга. Трансдукция эффективность была проанализирована визуализация-галактозидазы выражения в контрольной группе.

    П. И. анализов. KC человек были предварительно обработанных в присутствии или отсутствии ингибиторов протеазы (ИП) разводят в антибиотикам свободную ячейку культуральной среде в течение 24 ч до оценки антимикробной активностью в отношении ФЗПНМ S.aureus. ЭДТА без PI коктейль, используемый подавляет различные серина и цистеина протеазы (Roche, Indianapolis, IN).

    Радиальные анализов диффузии. Log-фазы золотистого стафилококка ФЗПНМ (10 мкл) вносили в стерильные агар верхней триптон (10 мл) при 50 ° C (1% агарозном-0.5% триптон). Бактериальной суспензии, содержащей около 105 КОЕ / мл бактерий, выливали в пластинах и позволила закрепить при комнатной температуре. Лунки перфорированные (2 мм) в пластинах помощью пипетки Пастера. KC человек (с или без 24-часового предварительной обработки PI) были извлечены в 1 М HCl-1% трифторуксусной кислоты, лиофилизированные и ресуспендировали в стерильной воде. Bicinchoninic анализов кислоты были проведены, чтобы подтвердить эквивалент загрузки белка, и 2 мкл каждого экстракта KC или контроль был загружен в трех экземплярах скважин. Синтетические LL-37 пептида служил положительного контроля и KC буфера для экстракции служили в качестве отрицательного контроля. Пластины инкубировали при 37 ° С в течение ночи, а фотографии были сделаны использованием ChemiImager 4400. Диаметр каждой зоне бактериального ингибирования роста измерялась с помощью NIH Imager программного обеспечения.

    Кератиноцитов анализов КОЕ. KC пассировали в отсутствие антибиотиков и культивировали до слияния в 24-луночных тканевой культуры. Чтобы оценить способность KC, чтобы убить бактерии, 104 КОЕ / мл лог-фазе золотистого стафилококка ФЗПНМ был добавлен в культуре клеток скважин содержащие антибиотиков среды. Бактерии центрифугировали на клетки при 350 мкг в течение 10 мин и инкубировали при 37 ° С в увлажненной 5% CO2-инкубаторы для различных времен. В каждый момент времени, общее содержимое лунок были собраны, высевают на АСП, и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С для перечисления КОЕ. Управление скважин без KC содержащихся бактерий, выращенных в одинаковых условиях.

    Гентамицин защиты анализа. >Человека и мыши KC выращивали до слияния и инкубировали с 104 или 108 КОЕ / мл лог-фазе золотистого стафилококка WT или ФЗПНМ. Анализы Гентамицин защиты были выполнены на основе ранее описанных методов (22, 36, 42, 66). Короче говоря, бактерий центрифугировали на клетки при 350 мкг в течение 10 мин и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. KC были затем промывали PBS и обрабатывали 100 мкг / мл гентамицина в течение 1 часа, чтобы убить внеклеточных бактерий. Для сбора внутриклеточных бактерий, KC промывают, трипсином, и лизировали в 0,025% Тритон Х-100-H2O. Лизаты высевали на АСП и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С для перечисления КОЕ.

 Источники