При добыче и переработке нефти образуются большие объемы отходов, которые содержат устойчивые и токсичные компоненты, в частности полициклические ароматические углеводороды, алканы, a также могут включать специфические продукты добычи и химического синтеза. Наиболее распространенный способ обращения с нефтесодержащими отходами – захоронение на специализированных полигонах, ресурс которых практически исчерпан. Строительство новых объектов невозможно с экологической точки зрения. В этих условиях возникает необходимость применения биологических методов обезвреживания и утилизации. Химический состав нефтесодержащих отходов варьирует в зависимости от их происхождения, особенностей технологий добычи и переработки нефти, что необходимо учитывать при выборе метода.
Интерес к сложившимся в почвах ассоциациям микроорганизмов, функционирующим в природных субстратах, и использованию их в биотехнологиях появился сравнительно недавно. В естественных условиях самоочищение почв осуществляется комплексом микроорганизмов. Однако при высоком уровне загрязненности самоочищающая функция резко снижается. Для ускорения очистки применяют микробные препараты – искусственно созданные из монокультур бактерий сообщества микроорганизмов, способных окислять углеводороды нефти. При этом возникает проблема устойчивости таких сообществ.
В природе микроорганизмы существуют в составе консорциумов, ассоциаций друг с другом и другими организмами, проявляя присущую им функциональную активность. Поэтому изучение естественных ассоциаций, их компонентов и биологической активности весьма актуально для получения препаратов нового поколения и эффективного решения задач биотехнологии.
Для выделения активного комплекса нефтеокисляющих микроорганизмов из загрязненных почвогрунтов использовали метод подпитки нефтью. Образцами для выделения популяции служили почвы с высоким содержанием углеводородов – от (250 300, 2 ÷ 3,5) мг/кг до (253 200, 6 ÷ 6,4) мг/кг – и низкой численностью разных групп микроорганизмов.
Комплекс нефтеокисляющих микроорганизмов получали в жидкой среде с начальными концентрациями нефти 30 мл/л, 50 мл/л и 70 мл/л в условиях продленного культивирования (в течение 12 суток). Пробы отбирали в начале эксперимента, а также на 3-и, 6, 9 и 12-е сутки. В накопительную культуру через каждые трое суток вносили нефть, сохраняя ее исходную концентрацию в среде. Установлено, что потребление нефти микроорганизмами зависит от исходного содержания углеводородов в среде (рис. 1).
В процессе формирования комплекса наблюдалось постепенное повышение количества разных групп микроорганизмов (наибольшее отмечено на 9-е сутки). Самая высокая численность углеводородокисляющих микроорганизмов получена при исходном содержании нефти в накопительной культуре 50 мл/л.
В популяцию сформировавшихся нефтеокисляющих комплексов входят бактерии, дрожжи и стрептомицеты. Численность бактерий от (14,1 ÷ 2,1)·107 до (8,5 ÷ 1,2)·108 КОЕ – значительно больше, чем дрожжевых организмов и стрептомицетов. Количество спорообразующих бактерий колеблется от (35,2 ÷ 1,1)·103 до (25,2 ÷ 0,7)·104 КОЕ.
Деструктивную активность нефтеокисляющих комплексов определяли гравиметрическим методом на 10-е сутки культивирования. Для этого биомассу микроорганизмов нефтеокисляющих комплексов, полученных при различных условиях, вносили в среду с содержанием нефти 30 мл/л, 50 мл/л и 70 мл/л. Наиболее высокой деструктивной активностью обладал нефтеокисляющий комплекс, сформированный при внесении нефти 50 мл/л в 1-е сутки его получения. Количество нефти, потребленной микроорганизмами комплекса, колеблется от (65,2 ÷ 1,2) до (80,2 ÷ 2,4) % в зависимости от ее исходного содержания (рис. 2).
При изучении состава комплекса выявлены микроорганизмы различных родов. Доминируют Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus и Pseudomonas. Наибольшее количество клеток – микроорганизмы рода Bacillus.
Определена деструктивная активность изолятов, составляющих доминантную микрофлору созданных нефтеокисляющих комплексов. Высокой деструктивной активностью обладали объекты, выделенные из комплекса, сформировавшегося при внесении в среду нефти в количестве 50 мл/л. На 10-е сутки изученные изоляты потребляли от (37,2 ÷ 1,2) до (76,2 ÷ 2,4) % углеводородов при исходном содержании нефти 70 мл/л. Среди 10 проверенных 2 изолята утилизировали более 70 % нефти.
Таким образом, методом продленного культивирования создано естественное сообщество микроорганизмов – высокоактивных деструкторов углеводородов.