НИИ медицинских проблем семьи ДГМУ, Донецк, Украина
Оригинал статьи расположен по адресу http://masters.donntu.ru/2005/kita/bayeva/library/art10.htm

Кинетику реакций спонтанного и стимулированного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) нейтрофилами крови человека исследовали in vitro. Индекс активации нейтрофилов (ИАН), характеризующий степень их активности, в зависимости от времени реакции (t) описали уравнением: ИАН = [НСТ0](1 - exp[-k1t]) + kot; ([НСТ0] - внутриклеточная концентрация НСТ, отражающая проницаемость мембран, k1 и ko - соответственно константы скоростей реакций первого и нулевого порядков, характеризующие стимулированную и спонтанную активности ферментных систем, участвующих в восстановлении НСТ). Установлено, что гепарин (2,0-7,5 мкг/мл) и хондроитинсульфат (0,25-2,5 мкг/мл) способны активировать нейтрофилы и, очевидно, могут поддерживать их спонтанную активность in vivo. Показано, что величины параметров кинетического уравнения позволяют судить об относительной гипер-, нормо- и гипофункции нейтрофилов, связанными с функциональным состоянием целостного организма. При этом значения [НСТ0] изменяется от 8 до 103 усл. ед., и между ним и константами скоростей реакций существует тесная взаимосвязь. Вид зависимостей k1 и ko от [НСТ0] различен у стимулированных и спонтанно активирующихся клеток. Последние являются исключительно нейтрофилами, которые, как показано ранее, продуцируют активные формы кислорода, вероятно, не на нужды фагоцитоза. Количество таких клеток составляет примерно 30-40 % циркулирующего пула нейтрофилов и положительно коррелирует с величиной [НСТ0] (r = 0,58; p < 0,05), что определяется более высокой проницаемостью для НСТ мембран нейтрофилов, активирующихся спонтанно. Различная способность активироваться спонтанно и при стимуляции, разные проницаемость мембран и активность ферментных систем подтверждают функциональную неоднородность нейтрофилов, которая обусловливает особенности их активации.

К л ю ч е в ы е с л о в а: нейтрофилы, нитросиний тетразолий, кинетика восстановления, доля и индекс активированных нейтрофилов, проницаемость мембран, активность ферментных систем.
П р и н я т ы е с о к р а щ е н и я: АФК - активные формы кислорода; НСТ - нитросиний тетразолий; ДАН - доля активированных нейтрофилов; ИАН - индекс активированных нейтрофилов; ИАНс и ИАНи - соответственно ИАН в спонтанной и индуцированной реакциях; Нк - нейтрофилы, интенсивно генерирующие АФК (камикадзе); Нс - нейтрофилы, менее активно продуцирующие АФК (самураи).

Одно из звеньев цепи фагоцитоза - генерацию активных формы кислорода (АФК) нейтрофилами - оценивают по способности этих клеток восстанавливать in vitro нитросиний тетразолий (НСТ) спонтанно и после стимуляции (Маянский, Маянский, 1989; Cuzytek et al., 1997; Маянский и др., 1999). Изучение кинетики восстановления нейтрофилами НСТ позволило показать, что при стимуляции имеет место их спонтанная активация (Герасимов, Калуцкая, 2000), выявить функциональную неоднородность нейтрофилов и дифференцировать два класса этих клеток (Герасимов, Игнатов, 2001). Оказалось, что нейтрофилы одного класса (Нк) - потенциальные фагоциты - действуют по принципу камикадзе (убей и погибни): контактируют с субстратом и интенсивно генерируют АФК, вследствие чего инактивируются. Нейтрофилы другого класса (Нс) продуцируют АФК в меньшей мере и исключительно с целью самозащиты, напоминая самураев, не контактируют с субстратом, не инактивируются и, вероятно, выполняют в фагоцитозе какие-то вспомогательные функции, например, контролируют действие вазоактивных медиаторов и комплемента (Паркер, 1989).
Можно предположить, что активация нейтрофилов имеет особенности, обусловленные присутствием среди них клеток двух классов. Для проверки этого предположения в данной работе анализировали кинетику восстановления НСТ нейтрофилами, активированными спонтанно и при стимуляции.

Венозную кровь 22 здоровых женщин-добровольцев (23-30 лет) стабилизировали гепарином (1,0-7,5 мкг/мл) или цитратом натрия (5 мкг/мл).
В каждом из 100 нейтрофилов внутриклеточную концентрацию НСТ ([НСТ0]) определяли полуколичественно по содержанию в клетке отложений диформазана (Герасимов, Калуцкая, 2000). Для этого микроскопически площадь занимаемую диформазаном в клетке сравнивали с площадью ядра. В случае отсутствия диформазана принимали активность клетки равную нулю. Когда отношение площади отложений диформазана к площади ядра составляло менее 1/3, от 1/3 до 2/3 и более 2/3 принимали активность нейтрофилов соответственно 1, 2 и 3. Подсчитывали долю активированных нейтрофилов (ДАН, %). В условиях проведения реакции отложения диформазана всегда находились внутри клетки, что согласуется с наблюдениями (Нагоев, и др., 1986). При этом в нейтрофилах с активностью 1 и 2 диформазан откладывается в виде отдельных гранул, а с активностью 3, как правило, просматривается ядро. Функциональная неоднородность нейтрофилов, проявляется, в частности, в различной степени восстановления ими НСТ (Герасимов, Игнатов, 2001), поэтому наряду с ДАН, рассчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН, усл. ед.) по общепринятой формуле (Меньшиков, 1987; Герасимов, Калуцкая, 1996):

где n активность нейтрофилов, Н_n - количество клеток из 100 нейтрофилов с активностью n. Находили количества Н_с = Н₁ + Н₂ и Н_к = Н₀ + Н₃ (Герасимов, Игнатов, 2001).
Поскольку ИАН - одна из характеристик распределения нейтрофилов по активности, используя критерий c², показали, что для оценки ИАН необходимо и достаточно анализировать не менее 100 нейтрофилов. Как и ранее, ИАН рассчитывали по активности 100 клеток в двух параллельных пробах, взятых из одного забора крови, с допускаемым расхождением между параллельными ± 9 %. В качестве стимуляторов использовали пирогенал или продигиозан. Предварительно показали, что увеличение концентрации продигиозана в реакционной смеси от 1,25 до 12,5 мкг/мл приводит к уменьшению количества выявляемых Н_к от 70-60 до 40-30 %. Это уменьшение, вероятно, обусловлено частичным ингибированием восстановления НСТ избытком стимулятора аналогично ингибированию ферментов избытком субстрата. Очевидно, по этой причине ранее при концентрации продигиозана 12,5 мкг/мл выявили лишь около 40 % Н_к (Герасимов, Игнатов, 2001). По данным Герасимова и Калуцкой (2000), количество этих клеток составляет 60-70 % пула циркулирующих нейтрофилов. Нами предварительно показано, что Н_к в таких количествах выявляются в диапазонах концентраций пирогенала 7-12 мкг/мл или продигиозана 1,0-1,3 мкг/мл. Таким образом, эти условия стимуляции считали оптимальными.
Активность ферментных систем, продуцирующих АФК, оценивали, как принято, рассчитывая значения кинетических параметров процесса восстановления нейтрофилами НСТ. Кинетические данные анализировали, учитывая их динамику в менструальном цикле (Герасимов, Калуцкая, 2000).
Использовали следующие реактивы: гепарин (Biochemy, Австрия); хондроитинсульфат (Sigma, США); продигиозан (Мосхимфармпрепараты, Россия); НСТ (Диа-М, Москва); пирогенал (НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, Россия); нейтральный красный, цитрат натрия, КН₂РО₄ и К₂НРО₄ (Реахим, Россия).

Изменение ИАН при спонтанном (ИАНс) и индуцированном (ИАНи) восстановлении НСТ описали уравнениями, использованными ранее; учитывали одновременное протекание спонтанной и индуцированной реакций (Герасимов, Калуцкая, 2000):

где [НСТ₀]- концентрация (внутриклеточная) вступившего в реакцию НСТ (усл. ед.), k_o и k₁ - соответственно константы скоростей реакций нулевого и первого порядка, которые, согласно формальному кинетическому описанию (2) и (3), имеют различную размерность - (усл. ед.)*c^-1 и c^-1, соответственно, t - время (с). Объединив уравнения (2) и (3), получаем:

Обработав экспериментальные данные в координатах уравнения (4), нашли численные значения [НСТ0], лежащие в пределах 8-103 усл. ед., k₁ - (0,14-1,16)*10^-3 c^-1 и k_o - (3,6-7,5)*10^-4 (усл. ед.)*c^-1, а также коэффициент корреляции r между ИАН_и и t (0,94-0,99; p < 0,05). Полученные значения констант уравнения (4) соответствуют найденным ранее (Герасимов, Калуцкая, 2000); величины и уровень значимости коэффициентов корреляций указывают на адекватность описания уравнением (4) процесса активации нейтрофилов. В процессе восстановления НСТ при стимуляции нейтрофилов часть из них активируется спонтанно. Для оценки этого вклада, используя значения k_o, по уравнению (2) рассчитали ИАН_с в каждом из 27 опытов за 30 мин (время завершения реакции) и нашли их среднее, которое составило 0,03 ± 0,013 усл. ед. Последнее значение отличается от нуля (p < 0,05) и в пределах погрешности совпадает (p > 0,1) с результатами прямого определения ИАН при активации нейтрофилов без стимуляции (0,04 ± 0,014 усл. ед.) (Герасимов, Калуцкая, 2000). Таким образом, стимуляция нейтрофилов не лишает их спонтанной активности.
Известно, что в отсутствие патологии спонтанно акти­вирующиеся нейтрофилы идентифицируются как Н₁ и Н₂ (Н_с, согласно (Герасимов, Игнатов, 2001)). При этом количество ДАН не превышает примерно 10 % пула циркулирующих нейтро­филов и среди активных клеток наблюдаются исключительно Н_с. При этом активация Н_с может стимулироваться, например гепарином, в том числе, вероятно, эндогенным. Нами выяв­лена способность нейтрофилов актироваться в присутствии мукополисахаридов (гепарина и хондроитин-4-сульфата). В пробах, куда мукополисахариды попадают исключительно с кровью (антикоагулянтом служил цитрат натрия), выявляется около 4 % активированных нейтрофилов. Добавление гепарина (2,0-7,5 мкг/мл) или хондроитинсульфата (0,25-2,50 мкг/мл) приводит к увеличению числа активированных клеток соответственно до 6-15 и 36-50 % и появлению среди них Н₃, то есть Н_к, согласно Герасимову и Игнатову (2001). По-видимому, именно мукополисахариды in vivo поддерживают спонтанную активность нейтрофилов.
Наряду с неодинаковой способностью к активации, функциональная неоднородность может проявляться разной активностью ферментных систем и степенью проницаемости мембран нейтрофилов двух классов, что приведет к различи­ям кинетических параметров реакции восстановления НСТ. На рисунке представлены значения констант k_o и k₁, характе­ризующих соответственно спонтанную и индуцированную ак­тивность ферментных систем, продуцирующих АФК, в зависи­мости от [НСТ₀]. Последний показатель отражает проницае­мость клеточных мембран нейтрофилов (Герасимов, Калуцкая, 2000). Функциональные зависимости k_o и k₁ от [НСТ₀] опи­сали соответственно:

k_o = 1,56*10^-7([НСТ₀] - 49,6)² + 3,33*10^-4, (5)

k₁ = 1,48*([НСТ₀] + 27,9)^-2. (6)

После линеаризации уравнений (5) и (6) нашли коэффициенты корреляции r между константами скоростей реакций и [НСТ₀] (0,82 и 0,89; p < 0,01), величины которых указывают на тесную связь между степенью проницаемости клеточных мембран для НСТ и активностью ферментов, в первую очередь гексозомонофосфатного шунта. Вид этой функциональной свя­зи различен в случаях спонтанно активирующихся и стимули­руемых нейтрофилов, что указывает на функциональную не­равнозначность Н_с и Н_к, что и предполагалось в работе (Герасимов, Калуцкая, 2000).

Как видно из рисунка, при увеличении [НСТ₀] примерно до 50 усл. ед. k_o снижается, а затем повышается, отражая изменение спонтанной активности ферментных систем. Инду­цированная активность нейтрофилов характеризует их потен­циальные возможности (Маянский, Маянский, 1989), которые, судя по величине k₁, непрерывно уменьшаются с увеличением [НСТ₀]. Существенно, что [НСТ₀] положительно коррелирует с долей Н_с среди всех нейтрофилов (r = 0,58; p < 0,05). Следовательно, повышение способности нейтрофилов погло­щать НСТ определяется увеличением доли именно Н_с (умень­шением доли Н_к), а проницаемость мембран Н_с, следователь­но, оказывается выше, чем у Н_к. Поскольку все кинетичес­кие параметры взаимосвязаны (уравнения (5) и (6)), то ве­личины k_o и k₁ также определяются долей Н_с. Таким обра­зом, выявленные закономерности очевидно обусловлены зави­симым от функционального состояния организма изменением соотношения клеток двух классов (Н_с и Н_к).

Обсуждая возможный вклад Н_с и Н_к в поддержание того или иного функционального состояния организма, заметим, что между k_o и k₁ вплоть до [НСТ₀] ~ 50 усл. ед. имеется корреляция (r = 0,75; p < 0,05), которая указывает на прямую связь между спонтанной и стимулированной активнос­тями лишь среди части нейтрофилов, то есть на их функцио­нальную неоднородность. Поскольку in vivo нейтрофилы про­являют свои функции при активации, то об их функциональ­ной неоднородности судили по величине k₁. Применив клас­терный анализ, выделили три группы клеток, различающихся активностью и проницаемостью мембран. Как видно из рисун­ка (б), среднему уровню проницаемости мембран ([НСТ₀] находится в диапазоне 25-60 усл. ед.) соответствует относительная нормофункция, тогда как понижение и повышение проницаемости мембран можно расценивать как проявление соответственно гипер- и гипофункции.

Поскольку исследовали нейтрофилы крови женщин, полу­ченные результаты сопоставили с литературными данными о функциональном состоянии организма в разные фазы менстру­ального цикла (Шахлина, 1997, Герасимов, Калуцкая, 2000, Жданов и др., 2002). Как и следовало ожидать, в соответс­твии с результатами этих исследований до и во время ме­сячных кровотечений наблюдается относительная гиперфунк­ция нейтрофилов, которая соответствует высокой напряжен­ности целостного организма. В середине фолликулиновой - начале лютеиновой фаз имеет место относительная релакса­ция функциональных систем организма и нейтрофилов. Нако­нец, в середине лютеиновой фазы относительно низкими ста­новятся как функциональный статус организма, оцениваемый по гемодинамическим и респираторным показателям (Шахлина, 1997), так и ферментативная активность нейтрофилов на фо­не компенсаторного повышения проницаемости их мембран (относительная гипофункция). Следовательно, функциональ­ное состояние нейтрофилов отражает функциональное состоя­ние целостного организма.

Выявленная взаимосвязь между активностью ферментных систем и проницаемостью мембран может быть обусловлена следующими причинами. Изменения активности НАДФ7Н₂-окси­дазы и ферментов гексозомонофосфатного шунта приводят к изменению продукции нейтрофилами супероксидного радикала. Уровень функционирования АФК, в свою очередь, отражается на физико-химических характеристиках среды, что влияет на проницаемость мембран. Однако, активность клеточных фер­ментных систем сама по себе зависит от функционального состояния целостного организма и определяется физико-хи­мическими характеристиками внеклеточной среды (Trevani et al., 1999), влияние которых опосредуется проницаемостью мембран и внутриклеточной средой. Следовательно, измене­ние проницаемости мембран отражается на активности фер­ментных систем нейтрофилов, что обусловливает связь между этими характеристиками.

Таким образом, в спонтанной реакции принимают учас­тие только Н_с, активность которых обусловлена присутстви­ем в крови эндогенных соединений, в частности гепарина и хондроитинсульфата. Стимуляция нейтрофилов приводит к ак­тивации как Н_к, так и Н_с, не лишая последние спонтанной активности. При этом активировавшиеся спонтанно Н_с допол­нительно не стимулируются. Выявлена тесная связь между проницаемостью мембран для НСТ и активностью участвующих в его восстановлении ферментных систем, вид которой раз­личен у спонтанно активирующихся и стимулируемых нейтро­филов. Показано, что проницаемость мембран Н_с выше, чем у Н_к. Приведенные факты подтверждают функциональную неодно­родность нейтрофилов и обусловливают особенности их акти­вации.

Список литературы

1. Герасимов И. Г., Калуцкая О. А. 2000. Кинетика реак­ции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека. Цитология. 42 (2) : 160 - 165.
2. Герасимов И. Г., Игнатов Д. Ю. 2001. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода. Цитология. 43 (5) : 432 - 436.
3. Жданов Е. В., Курлович Н. А., Машьянова И. А. 2002. Ритмическая организация резистентности у женщин репродук­тивного возраста. Бюл. эксп. биол. и медицины. 133 (3): 257 - 261.
4. Маянский А. Н., Маянский Н. А., Заславская М. И., Позднеев Н. М., Плескова С. Н. 1999. Апоптоз нейтрофилов. Иммунология. (6) : 11 - 20.
5. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. 1989. Очерки о нейтро­филе и макрофаге. Новосибирск: Наука. 340.
6. Меньшиков В. В. 1987. Лабораторные методы исследова­ния в клинике. М.: Медицина, 364 с.
7. Нагоев Б. С., Шубич М. Г., Гржибовская Л. Н. 1986. Стимуляция НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов бактери­альными препаратами у здоровых людей. Лаб. дело. (5) : 273 - 276.
8. Паркер Ч. В. 1989. Нейтрофилы. Иммунология: в 3-х тт. Т. 3. М.: Мир. : 173 - 179.
9. Шахлина Л. Г. 1997. Реакция функциональной системы дыхания на циклические изменения гормонального состояния организма женщины. Вестн. Рос. АМН. (5) : 23 - 27.
10. Cuzytek A., Hrycek A., Stasiura H., Stadnicki A. 1997. Peripheral blood neutrophils in patients with in­ternal endometriosis in light of enzymatic tests. Wiad. Lek. 50 (4 - 6) : 75 - 80.
11. Trevani A. S., Andonegui G., Giordano M., Lopez D. H., Gamberale R., Minucci F., Geffner J. R. 1999. Extra­cellular acidification induces human neutrophil activati­on. J. Immunol. 162 (8) : 4849 - 4857.

Подпись к рисунку

Спонтанная (а) и индуцированная (б) активность нейт­рофилов в зависимости от внутриклеточной концентрации вступившего в реакцию НСТ.

По оси абсцисс - k_o*10^-4 (а), усл. ед.*c^-1, или k₁*10^-4 (б), c^-1. По оси ординат - [НСТ₀], усл. ед. Вертикальными штриховыми линиями ограничены области значений констант, соответствующие гипер-, нормо- и гипофункции нейтрофилов.

PECULIARITIES OF NEUTROPHILS ACTIVATION IN VITRO

I. G. Gerasimov, D. Y. Ignatov

The kinetics of spontaneous and induced reactions of nitroblue tetrazolium (NBT) restorring by neutrophils was investigated in vitro. The index of activated neutorphils (IAN), that is characteristic of cell activation degree (Gerasimov, Kalutskaya, 2000), depending on reaction time (t) was described by equation: IAN = [NBT₀](1 - exp[-k₁t]) + k_ot; ([NBT₀] - intracellular concentration of NBT, which reflects membrane permeability, k₁ and k_o - speed constants of first and zero order reactions, which are corresponding characteristics of stimulation and spontaneous activities of ferment systems taking place in NBT restorring). The ability of heparin (2.0 - 7.5 mkg /ml) or chondroitin sulfate (0.25 - 2.5 mkg/ml) to activate neutrophils for NBT restorring and in vivo evidently maintain their spontaneous activity was found out. It had shown that the values of kinetics equation parameters allow to judge about related hyper-, normo-, and hypofunction of neutrophils, which reflects functional state of all organism. While [NBT₀] changes from 8 to 103 relative units and between this index and reaction speed constants high correlation exists, which kindes are different in the stimulated and spontaneous activating cells. The last ones are only neutrophils, which, as showed before, produce active forms of oxygen, but probably not for phagocytosis needs. The share of such cells is approximately 30 - 40 % of neutrophils recirculating pool and positively correlates with [NBT₀] (r = 0.58; p < 0.05), that is determined by the bigger membrane permeability of this neutrophils subpopulation. The different spontaneous and stimulated ability, various membrane permeability and ferment systems activity confirm neutrophils functional unequality, which is cause of their activation peculiarity.