ТРЕХМЕРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛ В БИОЛОГИЧЕСКИХ УЧЕБНЫХ ЦЕЛЯХ

Авторы: J. Barrere, J-Y. Dupont, N. Salame

МПИН - лицей Поля Луи Курье

Перевод с французского: И.И. Гунченко

Источник (фр.): http://www.inrp.fr/Tecne/Rencontre/PdfJet95/Dupont.pdf

Аннотация

МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ МОДЕЛЯХ

Методы секвенирования позволяют определить первичные структуры, которые входят в состав генов и белков. Тысячи секвенированных методов теперь доступны, они существенно продвинули наши знания о генетической информации о механизмах, показывающие разнообразие биологических молекул и эффектов мутаций, которые могут привести к фенотипическим изменениям.

В то время как гипотеза об относительной значимости формы молекулы была выдвинута в 1946, Pauling и Astbury в 1951 году предложили теоретические модели вторичной структуры (альфа-спирали и бета-листа). В это период шло развитие методов дифракции рентгеновских лучей, Kendew и Perutz предложили первую модель молекулы миоглобина. В 1953 году Crick et Watson смоделировали ДНК в виде двойной спирали. Уточняется идея взаимосвязи между структурой и функцией белков. Сейчас она находится в центре внимания многих молекуляристов. В учебной программе для старших курсов включили трехмерное представление строений биологических молекул. Таким образом, в научной программе для специалистов включены вопросы о "свойствах молекулы ДНК, ее структуре (...), последовательности аминокислот, структуре белка в трехмерном виде, комплементарности между областью молекулы фермента и соответствующей области субстрата молекулы необходимые для проведения реакции ", ...

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ РЕСУРСЫ ДЛЯ ОБУЧЕНИЯ

До последних лет иллюстрации и макеты выступали обучающим материалом для трехмерного представления в молекулярной области. В настоящее время международные базы данных предоставляют большую часть данных для трехмерного представления структуры молекул. Таким образом, в настоящий момент для биологов существует Protein Data Bank (PDB, главный справочный банк) молекул, содержащий информацию о: нуклеиновых кислотах, генетической информации (ДНК-молекулы, РНК-молекулы), белках, их структуре, функциях (инсулин, гемоглобин окисляется, уменьшается, трипсиноген, химотрипсин) ферментах и ферментативного катализа (химотрипсин, ацетилхолинэстераза, лактатдегидрогеназа, каталазы и т.д.)., гормонах-рецепторах (с ферментом роста), иммунологии (HLA и самостоятельных пептидах, Т4 лимфоцитах), эволюции и т.д.

Информацию о молекулах можно найти в файлах данных для каждой молекулы, в ней последовательно обозначен каждый атом, группа, к которой она принадлежит (аминокислота или нуклеиновой кислоты, или др.), координаты по оси Ох, Оу, Оz и, при необходимости, информация о структуре (количество каналов, количество и длина спирали, дисульфидные мостики и т.д..), группах. Для обработки этих данных на ПК существует несколько программных обеспечений, среди которых наибольший интерес представляет Rasmol, подробнее о нем далее.

Программное обеспечение Rasmol, работающее под Windows, состоит из трех окон: окно доступа к макрокомандам (меню), окно отображения изображения, окно, в котором одновременно размещается информация (последовательности, природа, позиция принадлежности атома, и т.д.), назначаются инструкции программе с помощью простого командного языка. Программа открывает файлы довольно больших молекул (более 10 000 атомов).

Программа включает в себя во-первых функции индикации информации (название молекулы, структуру последовательности цепи), которые считываются из PDB файла. Программа допускает отображения молекулярной модели в виде: сфер, стержней, углеродного скелета и др. Связи представлены по-разному в зависимости от их природы: ковалентная, водородные и дисульфидные мостики. По умолчанию, атомы и связи окрашены обычным способом, но их цвета можно менять. Программа также обеспечивает возможность интерактивно манипулировать молекулами, отображая по трем осям вращения, обеспечивает перемещение и изменение масштаба.

Все элементы, входящие в состав молекулы, доступны, если щелкать непосредственно по ним на экране. Так же можно определить и получить информацию о расстояниях и углах между атомами. Для исследования объема, меняется интенсивность контрастов, молекулу можно включить в параллелепипед или можно задать для отображения систему координат с началом в центре тяжести молекулы. Изучение объема также может быть сделано путем серийных срезов.

Наконец-то теперь есть возможность отбирать какое-то элементарное подмножество элементов в зависимости от физико-химических свойств их составляющих. Скрипты могут связать вместе серию обработанных экспортированных изображений, загруженных в различных форматах.

РУКОВОДСТВО К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

Вместо того чтобы следовать иллюстрированному руководству по использованию, для понимания трехмерной структуры молекулы, наш подход заключается в том, чтобы дать возможность студентам самим заниматься исследованием и открытием.

Здесь не описаны последовательности действий по использованию программного обеспечения, а представлены уровни, показывающие функциональные возможности программы. Первый уровень, чтобы изучить структуру и организацию молекулы, включая связи. Во втором уровне необходимо связать структуры и функции. В третьем уровне необходимо обнаружить, что функция молекулы не обязательно может быть связана с фиксированной структурой.

Исследование трехмерной структуры молекулы

В многочисленных случаях, если речь идет о молекулах больших размеров, общая форма ее уже исследована с помощью других методов: наблюдения за ДНК электронной микроскопией, где видны ее нитевидные формы. Для белка, например, гемоглобина или иммуноглобулина – это шарообразная форма. Молекулярная 3D визуализация должна в первую очередь позволить обнаружить именно эту форму. В случае ДНК, просмотр показывает общую форму молекулы: при манипуляции ею в пространстве, легко определяется ее волокнистая форма. Вращение вокруг ее главной оси также помогает сохранить ее спиральную структуру (рис. 1).

Рисунок 1 – Визуализация молекулы ДНК в сферах, показана ее волокнистая форма и спиральная структура

Также, на виде сверху, будет показано круглое сечение и светящиеся (богатые азотом) молекулярные единицы, которые расположены в центре. Зная условные обозначения цветов атомов, можно определить основные химические элементы (P, C, O, N, H).

Визуализация палочками более наглядна, давайте посмотрим, как в молекуле расположены различные химические элементы, указанные выше: вот когда можно заметить определенные закономерности для всей молекулы. Идентификация каждого из хим. элемента реализуема: выводится крупный план на изображении молекулы и определяется, с помощью справки, соответствующая формула, содержащая элементы этой молекулы (азотистые основания, рибоза, дезоксирибоза, фосфорная кислота). Главным образом надо посмотреть, что они расположены в форме двух сплетенных нитей в пространстве (двойная спираль). Можно также обнаружить, что определенные группы (азотистые основания) в каждой пряди сталкиваются без видимых химических связей.

Это позволяет понять связи в целом. Исследование модели отображенной на экране в палочках, уже показало, что именно азотистые основания занимают центральное пространство. Представим, что эти основания лежат в одной плоскости (есть комплементарные пары оснований). Отсутствие очевидных связей показывает, что они не объединены ковалентными сильными химическими связями. Тогда можно искать слабые связи, электростатические, которые располагаются между химическими группами, при условии, что они противоположно заряжены и находятся на некотором расстоянии (от 0,15 до 0,22 нм). Выбираются из общей модели пары нуклеотидов, с помощью опции «Геометрия», щелкая по двум противоположным атомам (например, O гуанина и тимина NH2), расстояние получается (например, 0,18 нм). Показано также условие для создания слабых связей (рис. 2).

Рисунок 2 – 2 нити молекулы ДНК соединены слабой связью между нуклеотидами, дополняющими друг друга

Таким образом, можно исследовать структуру этой молекулы путем изменения режимов просмотра, вращая ее в пространстве, выбирая шаблоны и делая измерения.

Связь структуры и функции на примере глобинов

Не стоит задача, чтобы обнаружить структуру белка в целом, но необходимо соотнести структуру молекулы с функцией, путем фиксации и транспортировки кислорода. Учащиеся уже знают, что белок производится путем связывания ряда аминокислот, цепи складываются в пространстве, форма общая для всех белков (спиральная обмотка, складывающиеся в листах).

Визуализация молекулы бета-глобина палочками показывает сложность его структуры. Первый вопрос, который может возникнуть, имеет ли эта молекула один или более каналов, которые последовательно выделены на дисплее. Для определения характеристик трехмерного расположения цепи, необходимо визуализировать упрощенную картину: в углеродосодержащем скелете или ленте. Таким образом, определены структурные подразделения в спиральной части, соединенные путем подключения сегментов. Селективное окрашивание этих областей возможно. Таким образом, надо понимать, что форма молекулы шарообразная.

Чтобы понять, как эта молекула обеспечивает связь с O2, один из подходов заключается в том, чтобы найти молекулу О2. Чтобы легко обнаружить атомы кислорода, необходимо выбрать цвет. Изменяя масштаб и манипулируя молекулой в пространстве, можно обнаружить связь двух атомов кислорода с атомом железа, который принадлежит виду под названием "Гем" (HEM101: FE) атомов. При выборе конкретного представления, чтобы положить его в качестве доказательства, мы находим, что он помещен в буфер, который расположен в центре молекулы и ограничен спиралями (рис. 3).

Рисунок 3 – Визуализация лентами альфа-глобина человека, 8 спиралей, стабилизированных многочисленными связями водорода

Отношение между структурной организацией и функцией молекулы не ясно, если будет установлено только на единственной молекуле. Учитывая огромные базы данных, возможно осуществить тот же поиск различных молекул (миоглобин, альфа-и бета-глобин, фетального глобина или принадлежащих к разным видам). Открытие тех же структур, спиралей и сопоставление номеров, подготавливающих тот же буфер гема, приводит к выводу, что такая компоновка конструкции молекулы, является связанно с функцией (рис. 4).

Рисунок 4 – Бета-глобин сопоставим с трехмерной структурой альфа-глобина

Анализ может быть продолжено, решив вопрос о сохранении гема в буфер. Мы можем предположить, что это сохранение выполняют некоторые из соседних аминокислот. Для того, чтобы устанавливать список используется функция, которая позволяет, вокруг атома или назначенной группы, автоматически отобрать все атомы, расположенные в радиусе определенного размера. Аминокислоты, которым они принадлежат, будут выявлены щелкнув на экране. Сравнение списков, установленных на различных молекулах глобинов, обнаруживает постоянное присутствие четырех аминокислот (два гистидина, фенилаланин, валин).

Они занимают в молекуле положения (42,58,62,87). Затем он подтверждается гипотеза, что трехмерная структура молекулы тесно связана с функцией.

Доказательство того, что белок является динамической структурой, на примере карбоксипептидазы

Визуализация в сферах показывает, что фермент имеет шаровидную форму. Индикация последовательности позволяет обнаружить существование полипептидной цепи из 307 аминокислот.

Для идентификации каталитического центра, работаем над изображением комплекса фермент-субстрат: цветная окраска субстрата (красный например) облегчает идентификацию и анализ каталитического центра. Взаимодополняемость формы появляется между подложкой и некоторыми аминокислотами. Допускаем, что химические элементы, которые принимают участие в катализе, располагаются вблизи от субстрата. Можно окрасить все элементы в радиусе 0,2 нм вокруг субстрата. Это позволяет отслеживать и определять число химических элементов: атом цинка, шесть аминокислот (HIS69, GLU72, HIS196, ARG145, TYR248 и GLN270).

Сравнение двух изображений, фермент только одной стороны, и фермент-субстратного комплекса с другой стороны, позволяет задать режим взаимодействия между ферментом и субстратом. Наблюдаем перегруппировки некоторых аминокислот в течение установления субстрата. Это наблюдение можно проделать, проводя измерения расстояний между химическими элементами, перемещенных в ходе образования комплекса. Показано, что TYR248 подвергается смещению почти на 1.2нм по отношению к атому Zn. Следствием этого сдвига является замыкание каталитического центра. Обнаруживаем так же, что структура фермента не жестка, она подвергается изменениям, необходимым для ее деятельности.

ИТОГ, ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Молекулярная визуализация является новой, о ней много говорят во многих книгах и руководствах. Поэтому очень важно ознакомить пользователей (преподавателей и студентов) с этим, для работы с такими средствами. Опыт показывает, что на практике студентам это позволило на биологическом материале (молекулы) вести исследования. С помощью визуализации, студенты проводят наблюдения под разными углами, в разных масштабах, в разных установках цвета (как с микроскопом), они собирают информацию путем проведения обработок изображений. Огромное количество данных, и простота реализации способствуют установлению концепции того, что мы хотим построить.

Эти мероприятия помогают сравнивать и схематизировать явления, которые студенты ранее изучали, что способствует более широкому представлению биологических процессов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. DAUNE [1995]. Biophysique moleculaire. Inter Editions.
2. FERMI PERUTZ [1984]. The crystal structure of human deoxyhaemoglobin. Journal of molecular biology, V175.
3. La recherche [1993]. Le sang, N° special 254.
4. La recherche [1991]. Le reploiement des proteines. N° 230.
5. LEHNINGER. Biochimie. Flammarion medecine.
6. LUBERT STRYER. Biochimie. Medecine Science, Flammarion.
7. MC CALL [1985]. The crystal structure of d(GGGCCC)ADN. Journal of molecular biology, V183.
8. PHILLIPS [1980]. Structure and refinement of oxymyoglobin. Journal of molecular biology, V142.
9. Pour la science [1993]. Voir les molecules biologiques. N° 183.
10. Pour la science [1993]. Les proteines, modeles moleculaires. N° 194.
11. SINGER [1992]. Genes et genome. Vigot.

Программное обеспечение

1. RASMOL : Roger Sayle, Biomolecular structure, Glaxo Research and Development, Greenford, Middlesex
2. INRP/CNAM - Images numeriques dans l'enseignement des sciences