Українська   English
ДонНТУ   Портал магистров

Реферат по теме выпускной работы

Содержание

Введение

Лечение трудно заживающих ран, язв и ожогов – одна из областей медицины, где достаточно давно и широко применяются и продолжают развиваться методы клеточной терапии.

В 1975 году было предложено применение культивируемых клеток кожи (кератиноцитов) при лечении ожогов. Кератиноциты – клетки, из которых состоит самый верхний, постоянно обновляющийся слой кожи – эпидермис. Чаще всего используется аутотрансплантация – т. е. у пациента берут маленький кусочек кожи, из него выделяют кератиноциты, выращивают их в культуре и закрывают полученным пластом раневую поверхность. Трансплантация выращенных эпидермальных пластов является одним из наиболее сложных и ответственных этапов технологии лечения, от правильного выполнения которой зачастую зависят результаты лечения.

Ниже приведены основные причины неудачных трансплантаций эпителиальных пластов [3]:

  1. Недостаточная готовность пластов к пластике. Оптимальным является пласт, состоящий из 8–12 слоев клеток. Преждевременная или поздняя пересадка малоэффективны.
  2. Пересадка незрелого (молодого) пласта. Как правило, поверхность культурального флакона зарастает клетками неравномерно. Обработка диспазой такой культуры приводит к неравномерному снятию пласта, с дырками. Эффективность такой трансплантации невысокая.
  3. Трансплантация перезрелого клеточного пласта. При наличии большого количества слоев клеток нарушается питание кератиноцитов базального слоя.

Одним из условий успешного приживления многослойного пласта кератиноцитов является их своевременная трансплантация на раны. Регулярный контроль жизнеспособности культивируемого пласта, поможет своевременно заметить возможные отклонения и принять решение о сохранении качественного фрагмента пласта или засевании матраса новой культурой. Проблема заключается в том, что несвоевременное освобождение матрасов от заведомо некачественных культур ведёт к потере значительных финансовых средств, а главное времени, которое зачастую является решающим фактором при лечении больных с обширными повреждениями кожного покрова. Количество оборудования для выращивания кератиноцитов, как правило, ограничено, а материал для пересадки, который нельзя сделать про запас, зачастую необходим в большом количестве и в сжатые сроки, например во время техногенных катастроф, которые распространены в нашей стране.

1. Описание предметной области

Количественный выход клеток из кожных лоскутов и эффективность их культивирования зависят от:

  1. Длительности хранения лоскутов кожи от момента срезания до начала выделения клеток.
  2. Температуры, при которой содержатся кожные биоптаты в процессе транспортировки из клиники в лабораторию, где осуществляется культивирование клеток.
  3. Состава среды, в которой находятся пробы кожи.

Температурный режим. В случае хранения при комнатной температуре кожных лоскутов, взятых от обожженных или доноров кожи, выделить из них достаточное количество жизнеспособных клеток не удается, пролиферация кератиноцитов в культуре происходит вяло. При хранении кусочков кожи в охлажденном состоянии (при t = + 4 °С) витальные свойства клеток сохраняются в течение длительного времени (в течение нескольких суток). Было установлено, что при выделении клеток в сроки в пределах до 48 ч после срезания кожи жизнеспособность кератиноцитов снижается незначительно и обеспечивается достаточный выход жизнеспособных клеток.

Таким образом, лоскуты кожи следует хранить при пониженной температуре (от 0 °С до + 4 °С), следует стремиться к тому, чтобы промежуток времени между отбором проб до начала выделения клеток был более коротким.

Выбор транспортной среды. Помимо температурного режима на жизнеспособность клеток влияет и состав среды, в которой транспортируют срезанные кожные лоскуты. В исследованиях перед началом хранения образцы кожи тщательно промывали в растворе Хэнкса с антибиотиками, а само хранение осуществляли при t = + 4 °С в среде Игла или среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота [4]. В Великобритании для этой цели используют среду DMEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков.

В значительно меньшей степени для хранения и транспортировки лоскутов кожи подходят солевые растворы (в частности, раствор Хенкса). Использование более простых растворов (глюкозы, 0,9% NaCl и др.) не позволяет осуществлять длительную по времени транспортировку.

Таким образом, в качестве транспортной среды следует использовать составы, применяемые для культивирования клеток и имеющие полный набор необходимых питательных веществ. Количество выделяемых из кожи клеток и их жизнеспособность во многом зависят от температурного режима хранения и от состава используемой транспортной среды.

Выделение кератиноцитов. Известно, что не все клетки эпидермиса обладают способностью к пролиферации. Для культивирования имеет смысл выделять, прежде всего, клетки базального слоя.

Культивирование кератиноцитов. Эффективность культивирования кератиноцитов и формирования многослойного пласта зависит от ряда факторов:

  1. Состояния клеток (их жизнеспособности и способности к пролиферации).
  2. Состава ростовой среды, используемых добавок и ростовых факторов.
  3. Вида субстрата, на который высеваются клетки.
  4. Конкретного варианта технологии культивирования.

Технология культивирования кератиноцитов чрезвычайно сложна и может быть реализована только в специализированных биотехнологических центрах. В настоящее время известно довольно много вариантов этой технологии, отличающихся друг от друга составом среды, наличием тех или иных добавок и ростовых факторов.

Культивирование клеток проводят в присутствии фидерного слоя трансформированных фибробластов линии ЗТЗ, предварительно обработанных митомицином С или облученных в сублетальных дозах для того, чтобы остановить их пролиферацию. В таком состоянии эти клетки кондиционируют ростовую среду биологически активными веществами, стимулирующими рост кератиноцитов.

Культивируют кератиноциты в чашках Петри или в специальных флаконах. Инкубацию клеток проводят в термостатах при температуре 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO2. В случае правильного выделения клеток базального слоя уже через 48 ч наблюдается образование колоний кератиноцитов. Ростовую среду меняют каждые 3–4 дня. При необходимости осуществляют пересев клеточной культуры.

Формирование многослойных пластов кератиноцитов. После посева полученной клеточной суспензии в культуральные флаконы кератиноциты прикрепляются и распластываются на поверхности подложки, после чего начинают активно делиться и формируют колонии. Последние постепенно сливаются друг с другом и формируют сплошной пласт кератиноцитов. Скорость формирования пласта зависит от многих факторов:

  1. От количества инокулируемых клеток и от их функционального состояния.
  2. От состава культуральной среды и используемых ростовых добавок.
  3. От способа подготовки подложки, т. е. от обработки дна культурального флакона.

Формирование многослойного пласта кератиноцитов при культивировании по методу Грина обычно занимает 3–4 недели. Образование клеточного пласта происходит в следующей последовательности: прикрепление и распластывание клеток, усиленное деление, формирование колоний и слияние колоний между собой на поверхности культурального флакона.

После прикрепления агрегата клеток достаточно быстро формируется колония. Единичные клетки также могут прикрепляться к поверхности подложки. В этом случае образуется относительно ровный монослой клеток. Колонии за счет деления клеток увеличиваются в размерах и постепенно сливаются. Центральная часть колоний в результате дифференцировки становится многослойной, происходит стратификация колонии. Через определенное время образуется сплошной многослойный (стратифицированный) пласт.

Определение степени готовности многослойного пласта кератиноцитов к трансплантации на раны. Одним из условий успешного приживления многослойного пласта является их своевременная трансплантация на раны. Для этого необходимо определить степень готовности многослойного пласта кератиноцитов к пересадке.

Молодой или недозревший пласт более тонкий, имеет более слабые межклеточные связи и в процессе ферментативной обработки диспазой может разрушиться. По мере стратификации клеточного пласта ухудшаются условия впитывания базального слоя кератиноцитов. По этой причине многомлойны пласт нельзя передерживать, необходимо своевременно оценить степень его зрелости и осуществить трансплантацию.

О зрелости клеточной культуры судят, главным образом, по картине, наблюдаемой в инвертированный микроскоп.

2. Постановка задачи

Важным этапом для проведения успешной операции, является определение жизнеспособности материала.

Определение жизнеспособности может проводиться различными методами. Наиболее простым является добавление специальных красителей, которые проникают внутрь клетки только при повреждении её оболочки. Таким образом, окрашенные клетки признаются не жизнеспособными. Естественно, краситель добавляется не в весь полученный материал, а только в его образец с последующим расчетом уровня жизнеспособности всех забранных клеток.

Более сложные методики оценки жизнеспособности сводятся к определению возможности клеток осуществлять свои функции [1]. Для этого в первичной культуре вычисляют уровень содержания специфических веществ, которые вырабатываются клетками в нормальном состоянии. Снижение концентрации этих веществ указывает на то, что внешне неповреждённая клетка может оказаться функционально неполноценной, то есть не пригодной для дальнейшего использования. К недостаткам этих методов причисляют временные затраты и субъективность получаемых результатов.

Проанализировав существующие методы определения жизнеспособности выращиваемых кератиноцитов, можно прийти к выводу, что они оказывают физическое воздействие на клетки [8]. Для этого необходимо регулярно выделять часть (пусть и небольшую) выращиваемой культуры. Таким образом, появляется задача разработки метода, не оказывающего физического воздействия на клетки.

3. Решение задачи

Для решения задачи оценки жизнеспособности кератиноцитов была выбрана методика обработки их изображений, так как использование этой методики не требует физического воздействия на клетки.

Входными данными в разрабатываемой системе будут снимки матрасов с клетками размером 512×512 пикселей, полученные при помощи камеры, установленной на микроскопе. Примеры снимков представлен на рис. 1.

Примеры входных снимков

Рисунок 1 – Примеры входных снимков
(анимация: 5 кадров, 6 циклов повторения, 127 Кб)

Далее должны быть получены его характерные признаки, которые можно будет использовать для классификации. Изображение слоя кератиноцитов имеет сложную текстуру. Также существует влияние оператора при получении снимков, так как микроскоп можно настроить на разный масштаб и повернуть его под разным углом. Поэтому существует потребность сделать изображение наклон‑ и масштаб‑инвариантным. Подобные задачи рассматривались в работе [2], при исследовании фибробластов. Для решения этой проблемы планируется исходное изображение подвергнуть лог‑полярному преобразованию.

Алгоритм лог‑полярного преобразования изображений кератиноцитов разделён на 2 основных этапа. На первом этапе радиус наибольшего круга (r) внутри данного изображения используется как сканирующая линия выборки (сэмплирования) S раз от 0° до 360° для получения эквивалентной S×[N/2] полярной формы (см. рис. 2a) [5]. Так, формально, полярная форма p(a, r) данного изображения f(x, y) размером N×N может быть вычислена как:

Формула 1

для a = 0, …, S – 1, и r = 0, …, [N/2] – 1.

На втором этапе логарифмическая функция применяется ко всем значениям радиуса в полярной форме, и их выходные величины квантуются на R состояний. Получаем лог‑полярное изображение размером S×R для заданного N×N изображения, как показано на рис. 2b.

Формула 1

для i = 0, …, S – 1, и j = 0, …, R – 1.

Лог-полярное преобразование

Рисунок 2 – Схематическое представление получения параметров для лог‑полярного преобразования: (а) – получение параметров полярной формы p(a, r), (b) – получение параметров лог‑полярного изображения

Далее из полученного лог‑полярного изображения планируется извлечь информативные признаки: удельную энергию и удельную энтропию. Для этого планируется использовать вейвлет преобразование [6, 7].

Выводы

Был проведен анализ существующих методов оценки жизнеспособности кератиноцитов и обоснован метод обработки изображений. По результатам проведенных исследований был разработан алгоритм обработки изображений и определения информативных признаков с целью оценки жизнеспособности выращиваемых кератиноцитов. В дальнейшем планируется проведение машинных экспериментов с эталонными снимками кератиноцитов, с целью проверки эффективности выбранного метода.

Список источников

  1. Смирнов С. В., Киселев И. В., Васильев А. В., Терских В. В. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов. [Текст]/ Смирнов С. В., Киселев И. В., Васильев А. В., Терских В. В. // Хирургия. Журнал им. Пирогова Н. И. – С. 25.
  2. Меркулова Е. В. Создание модели процесса определения жизнеспособности культивируемых фибробластов для автоматизированной системы. [Текст]/ Меркулова Е. В. // Вестник Херсонского Государственного технического университета. – Херсон: ХГТУ. – 2004 р. – № 1 (19).
  3. Клеточные технологии в лечении ран, язв и ожогов/ [Интернет‑ресурс] – Режим доступа: http://www.cmbt.su.
  4. Хранение и траспортировка лоскутов кожи/ [Интернет‑ресурс] – Режим доступа: http://www.rusmedserver.ru.
  5. Пан Ч. М., Ли М. Ч. Лог‑полярные вейвлет сигнатуры для классификации текстур/ [Интернет‑ресурс] – Режим доступа: http://masters.donntu.ru.
  6. Яковлев А. Н. Примеры вейвлет‑преобразований.[Текст]/ Яковлев А. Н. // Введение в вейвлет‑преобразования – Новосибирск – 2003 г.
  7. Адамов В. Г., Каира В. В. Компьютерная система прогнозирования сроков созревания кератиноцитов [Текст]/ Адамов В. Г., Каира В. В.// Моделювання та керування станом екологоекономічних систем регіону. – Київ: Міжнародний науково‑навчальний центр інформаційних технологій та систем НАН України та МОН України, 3 вип., 2006. – С. 234.
  8. Адамов В. Г., Киселев К. И., Меркулова Е. В. Определение функционального состояния кератиноцитов с помощью компьютерной обработки изображений клеток/ [Интернет‑ресурс] – Режим доступа: http://ea.donntu.ru:8080.