Цель магистерской работы: автоматизация процесса оценки функционального состояния клетки и детализация результатов оценки.
Преимущества метода
На сегодняшний день существуют различные методы и системы для оценки функционального состояния клеток. Одним из таких методов является оценка доли включений какого-либо вещества в клетку. В отличие от других методов, в которых исследуются совокупности клеток и делается вывод по их электрическим и оптическим свойствам, данный метод основан на работе с изображениями клеток, что позволяет учитывать свойства каждой клетки в отдельности.
Объектом исследования (ОИ) являются нейтрофилы крови человека (рисунок).
Рисунок 1. Снимок нейтрофила крови человека.
Нейтрофилы — самая большая группа белых кровяных телец, они составляют 50-75% всех лейкоцитов. Свое название они получили за способность их зернистости окрашиваться нейтральными красками. В зависимости от формы ядра нейтрофилы делятся на юные, палочкоядерные и сегментоядерные, имеющие две и более долей.
В лейкоцитарной формуле юные нейтрофилы составляют не более 1%, палочкоядерные — 1-5 %, сегментоядерные — 45-70 %.
Нейтрофилы созревают в костном мозге в течение 6-11 дней, после чего выходят в кровяное русло, где передвигаются током крови и дозревают около 10 часов. В крови циркулирует не более 1 % имеющихся в организме нейтрофилов. Основная их часть сосредоточена в тканях. Наряду с этим в костном мозге имеется резерв, превосходящий число циркулирующих нейтрофилов в 50 раз. Выброс их в кровь происходит по первому требованию организма.
Основная функция нейтрофилов — защита организма от проникших в него микробов и их токсинов. Нейтрофилы первыми пребывают на место повреждения тканей. Их появление в очаге воспаления связано со способностью к активному передвижению. Они проходят через стенку капилляров и активно перемещаются в тканях к месту проникновения микробов. Затем нейтрофилами производится активный захват и поглощение чужеродных элементов, так называемый фагоцитоз. Фагоцитоз – одна из защитных реакций организма, проявляется, главным образом, при воспалении, открыт в 1883 г. И. И. Мечниковым.
Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)
Оценка состояние фагоцитарной активности нейтрофилов производится по результатам постановки спонтанного и стимулированного теста с нитросиним теразолием (НСТ-тест). Нитросиний тетразолий поглощается нейтрофилами и под влиянием их дегидрогеназной системы бесцветный НСТ восстанавливается в темно-фиолетовые гранулы диформазана. Цитоплазма окрашивается в розоватый цвет.
Рисунок 2. Схема событий, приводящих к образованию диформазана.
Стимуляция нейтрофилов экспресирует НАДФ * Н2-оксидазу; та в свою очередь, катализируя НАДФ * Н2до НАДФ, активирует ГМФШ, в процессе которого нарабатывается новая порция НАДФ * Н2 и замыкается положительная обратная связь. НАДФ * Н2 служит источником электронов, переводящим молекулярный кислород в супероксидный анион, который и восстанавливает НСТ до диформазана.
Сравнительное изучение этой реакции при спонтанном и стимулированном НСТ-тестах позволяет судить о функциональной активности нейтрофилов и потенциальных ресурсах системы фагоцитоза. По современным данным эти сведения являются одними из наиболее важных показателей состояния неспецифической защиты организма.
Оценка результатов
С помощью светового микроскопа исследуют каждую клетку. Для оценки результатов в 100 клетках подсчитывают долю активированных нейтрофилов (ДАН, %), содержащих включения диформазана.
Каждый из изученных нейтрофилов по интенсивности реакции (по количеству выпавшего диформазана) относят к одной из четырех групп, состоящих из клеток с активностью 0 (0% заполнения), 1 (0 < 30% заполнения), 2 (30…50% заполнения) и 3 (50…100% заполнения) балла. Затем рассчитывается индекс активации нейтрофилов (ИАН, усл. ед.) по формуле (рисунок):
где Н0, Н1, Н2, Н3 – количество нейтрофилов с активностью 0, 1, 2, 3 балла соответственно.
В норме ДАН не должна превышать 12% и 30% для спонтанного и стимулированного НСТ-тестов соответственно. Несоответствие этого показателя предусмотренным нормам позволяет говорить о нарушениях функционирования организма и о патологиях.
Задача магистерской работы
Задача данной магистерской работы заключается в нахождении доли заполнения нейтрофила диформазаном. Она решается с помощью методов цифровой обработки изображения и представляется в виде совокупности подзадач: повышение качества введенного изображения, определение его гистограммных признаков и, наконец, нахождение порогового ограничения яркости, соответствующего участку клетки, заполненному диформазаном.
Заключение
В данное время все расчеты ведутся вручную. Это очень трудоемкий процесс. А также оценка заполнения нейтрофила диформазаном производится специалистами визуально, что может свидетельствовать о достаточно большой погрешности в результатах исследования. Компьютеризация данного процесса может значительно расширить возможности врача-исследователя, позволяя ему рассматривать клетки не только с позиции отнесения их к одной из четырех групп активности (0, 1, 2, 3 балла).